尼妥珠单抗联合化疗药物对人结肠癌细胞的实验研究及对PI3K/Akt信号通路的影响

摘要

结直肠癌是最常见恶性肿瘤之一，在2000年，全世界大约有90万新诊断病例，其中49万死于该病。结直肠癌占每年新诊断肿瘤病例的10～15%。结直肠癌在我国，特别是大城市的发病率以年均4.2%的速度递增。诊断为早期的患者通常可以通过外科手术得到治愈，然而40%～50%患者在临床确诊时已处于局部进展或远处转移，因此失去手术治疗机会，无法切除的转移病灶又是导致转移和复发的主要原因，对这些患者，辅助治疗和姑息治疗是提高疗效、改善生存质量的有效治疗手段。主要包括以氟尿嘧啶、伊立替康及奥沙利铂为基础的治疗。然而当患者对这些化疗药物产生耐药后，治疗效果明显下降，需要新的化疗药物及治疗方法来提高疗效。近年来，分子靶向药物的应用为结直肠癌的治疗提供了新的途径并取得了重大进展。 EGFR是酪氨酸激酶生长因子受体家族重要成员，通过与配体结合后引起受体构象改变，胞内酪氨酸激酶的活化，蛋白质磷酸化和刺激多种细胞信号传导通路，如motigen-activated protein kinases（MAPK）和phosphatidyl-inositol-3 kinase（PI3K/AKT）通路，引起基因转录和细胞周期变化，从而引起下游一系列信号通路的活化，这些通路的激活最终会导致细胞的增殖、逃避凋亡及癌细胞浸润和转移。近年来研究发现，PI3K/Akt通路不仅与细胞的增殖、凋亡有关，而且在肿瘤的生长、对化疗的反应方面都扮演着重要角色。特异性抑制PI3K/Akt通路的活性可减少肿瘤细胞的化疗耐药性，通路抑制剂联合化疗可增强化疗效果，这提示了PI3K/Akt通路可作为肿瘤治疗的潜在靶点。结直肠癌患者常伴有EGFR的高表达（25～80%），并往往提示预后不良，针对EGFR的抗体的研究及应用，是近年来肿瘤学研究的热点，西妥昔单抗是人-鼠单克隆嵌合抗EGFR抗体，单药及联合化疗或联合放疗在临床治疗中已展现出令人满意的结果，有效地提高了进展期结直肠癌患者的中位生存期。多项临床研究显示西妥昔单抗（Cetuxizu-mab，C-225）能够显著抑制肿瘤细胞的生长。然而，大量的临床研究结果显示，C-225的疗效与肿瘤细胞的EGFR表达情况没有明显的相关性，而临床上也不能将EGFR的表达情况作为判断患者是否适合接受C-225治疗、以及对疗效进行预测的指标[11，12，13]。 与西妥昔单抗相似的，尼妥珠单抗（Nimotuzumab，h-R3）是一种特异性结合EGFR胞外结构域的人源化单克隆抗体，以高度人源化、高选择性、半衰期更长而受到广泛的关注。临床前研究证实可以阻断EGFR与其配体的结合，并对EGFR过度表达的肿瘤具有抗血管生长、抗细胞增殖和促进凋亡的作用。Amil Shah等进行的II期临床研究表明，h-R3联合伊利替康对伊利替康耐药的转移性结直肠癌显示有效。加拿大14个临床研究中心开展的h-R3联合伊利替康治疗伊利替康耐药的转移性结直肠癌临床研究得出，h-R3能够逆转化疗的耐药，伊利替康治疗失败的转移性结直肠癌患者，接受h-R3联合伊利替康治疗，生存获益显著。但目前尚无与其他化疗药物联合在结直肠癌治疗中的相关实验数据。本研究通过将靶向EGFR的单克隆抗体尼妥珠单抗与治疗结肠癌几种常用化疗药物联合对EGFR表达不同的结肠癌细胞作用，了解药物之间的相互作用及对EGFR下游PI3K/Akt信号通路的影响，探讨其可能的联合作用机制，对临床及实验研究提供一定的依据。 研究目的: 本课题旨在研究分子靶向药物尼妥珠单抗与化疗药物联合对2种EGFR表达情况不同的人结肠癌细胞体外生长的抑制作用，并探讨其疗效与EGFR表面表达情况是否相关及可能的效应机制。通过对细胞信号转导相关分子的检测从细胞信号传导方面探讨二者联合的可能分子机制。 研究方法: 第一章尼妥珠单抗联合化疗药物对2种人结肠癌细胞体外生长的抑制作用 1.流式细胞术检测两种结肠癌细胞LoVo、Colo205表面EGFR表达情况。 2.人结肠癌细胞体外传代培养，细胞培养至对数生长期后实验细胞分为4组：分别为空白对照组、尼妥珠单抗单药组、化疗药物单药组（氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂）、尼妥珠单抗联合化疗药物组。检测细胞增殖抑制率时尼妥珠单抗药物剂量设6.25、12.5、25、50、75、100μg/ml6个浓度组；CPT-11药物剂量设6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml6个浓度组；L-OHP设0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/ml6个浓度组；5-Fu设0.25、0.5、1、2、4、8μg/ml6个浓度组；尼妥珠单抗联合化疗药物时剂量选择为50μg/ml，化疗药物剂量仍为以上6个浓度组。 3.以MTT法检测24、48、72h时间点药物抑制人结肠癌细胞增殖的作用，根据OD值计算细胞生长抑制率。 4.细胞培养同上，用流式细胞仪于尼妥珠单抗作用后24h检测细胞周期、48h检测细胞凋亡，并计算凋亡率。 第二章尼妥珠单抗联合化疗药物抑制2种人结肠癌细胞生长机制的初步探讨。 1.人结肠癌细胞体外传代培养，细胞培养至对数生长期后实验细胞分为2组：分别为空白对照组、尼妥珠单抗单药组。尼妥珠单抗药物剂采用50μg/ml；作用时间为72h。 2.Western-Blot法检测2种人结肠癌细胞中PI3K/AKT信号通路各相关分子PTEN、PI3K、AKT、phospho-Akt（Ser473）、c-Raf. GSK-3β及phospho-GSK-3β蛋白表达。 3.PCR法检测上述信号通路蛋白PTEN、PI3K、AKT、Raf-1及GSK-3β的基因表达水平。 注：统计分析：所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计处理，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间细胞半药抑制浓度（IC50）比较采用重复测量方差分析；多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐的采用Tamhane's T2法；两组比较用独立样本t检验；显著性标准为α=0.05，P<0.05有统计学意义。 研究结果: 第一章尼妥珠单抗联合化疗药物对2种人结肠癌细胞体外生长的抑制作用 1.流式细胞术测细胞表面EGFR情况，LoVo细胞EGFR呈高水平表达，Colo205细胞呈低水平表达。 2.MTT比色法结果显示，不同浓度尼妥珠单抗对两种人结肠癌细胞LoVo及Colo205细胞增殖均无明显杀伤作用，尼妥珠单抗与化疗药物伊立替康、氟尿嘧啶联合，不同浓度及作用时间抑制率比较，差异具有统计学意义（P=0.000），单药伊立替康与联合组之间比较差异具有统计学意义（P=0.000），单药氟尿嘧啶与联合组之间比较差异具有统计学意义（P=0.000，0.002），而单药奥沙利铂与联合组之间比较，两种细胞结果不同，LoVo细胞两组比较差异不具有统计学意义（P=0.126），Colo205细胞两组比较差异具有统计学意义（P=0.003）。 3.流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期显示，单药尼妥珠单抗可诱导LoVo细胞产生凋亡及引起G0/G1期阻滞，与对照组比较差异均具有统计学意义（P=0.025，0.001）；单药尼妥珠单抗可诱导Colo205细胞产生凋亡及引起G0/G1期阻滞，与对照组比较差异均具有统计学意义（P=0.012，0.000）。 第二章尼妥珠单抗联合化疗药物抑制人结肠癌细胞生长机制的初步探讨 1.Western-Blot结果显示，尼妥珠单抗对两种细胞均上调PTEN，能下调PI3K、p-AKT蛋白表达，进而下调p-GSK-3β蛋白表达，但总的Akt、c-Raf及GSK-3β蛋白水平无明显改变。 2.PCR结果显示，尼妥珠单抗对LoVo及Colo205均上调PTEN基因的表达（P=0.001），能下调PI3K基因的表达（P=0.008，0.000），对总的Akt（P=0.286，0.607）、Raf-1（P=0.847，0.0.760）及GSK-3β（P=0.355，0.572）的基因表达无明显改变。 结论: 尼妥珠单抗单独应用在体外不论对EGFR高表达或EGFR低表达的结肠癌细胞均无明显抑制作用，氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂分别单独应用对两种细胞均有抑制增殖作用，h-R3能有效提高化疗药物伊利替康与氟尿嘧啶体外对两种结肠癌细胞抑制作用的敏感性，与奥沙利铂联用时的疗效与细胞株的种类有关。两药联合的效应机制可能与细胞信号转导通路有关，尼妥珠单抗可以通过下调PI3K/Akt信号通路，而引起细胞产生更多的凋亡及引起细胞发生G0/G1阻滞，增强化疗药物的细胞毒作用。

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文摘

英文文摘

论文说明:中英文对照缩略词表

声明

前言

第一章 尼妥珠单抗联合化疗药物对2种人结肠癌细胞体外生长的抑制作用

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第二章 尼妥珠单抗联合化疗药物抑制人结肠癌细胞生长机制的初步探讨

1材料和方法

2结果

3讨论

4参考文献

全文小结

攻读硕士学位期间成果

致谢

统计学证明