肠缺血再灌注损伤时肠黏膜musashi-1、PCNA的表达及其意义

摘要

目的: 本研究是以小鼠小肠为研究对象，以肠缺血再灌注损伤（intestinal ischemia and reperfusion injury，IIRI）模型为基础，通过观察小肠黏膜的组织学改变，了解IIRI对小肠黏膜的损伤作用；通过检测肠上皮干细胞的标记物musashi-1（msi-1）以及增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在肠黏膜的表达变化，探讨在IIRI时肠黏膜损伤修复过程中肠上皮干细胞的作用机制。同时通过检测msi-1 mRNA在肠IIRI不同时期的表达，从基因水平探讨msi-1对小鼠小肠上皮干细胞的增殖发育可能发挥的生物学作用。 方法: 健康成年雄性昆明小鼠50只，体重18-22g。随机分为5组，即：IIRI6h组、IIRI12h组、IIRI24h组、IIRI48h组和空白对照组，每组10只。采用肠系膜血管夹闭法制作肠IIRI模型，手术前12h，小鼠禁食，不限制饮水。经腹腔注射0．3%戊巴比妥1mL/kg（体重），麻醉成功后固定于手术台，常规消毒铺巾，经腹正中线切开腹壁，打开腹腔，找到并分离肠系膜上动脉，用无损伤动脉夹夹闭其根部，湿纱布覆盖腹壁。在肠系膜上动脉夹闭期间，间断地向腹腔内注入生理盐水约15～20mL/kg（体重），以预防松开动脉夹后出现的一过性低血容量反应。20min后去掉动脉夹，消毒皮肤，缝合腹壁。关腹后再向腹腔内追加含庆大霉素32万U/L的生理盐水约25～30mL/kg（体重），以达到扩容和预防腹腔手术时可能的污染。术后一笼一鼠，自由饮食。分别于IIRI术后6、12、24、48小时处死小鼠，距回盲部约10cm处取小肠组织约4cm，其中2cm标本加入10%中性甲醛中固定，1、HE染色，光镜下观察肠黏膜病理改变，免疫组织化学，检测分析PCNA和msi-1表达及其指数；另2cm标本及时投入盛有RNAlater的EP管中，4℃过夜后-80℃冰箱中保存，待行RT-PCR检测msi-1 mRNA在肠道黏膜上皮的表达。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用完全随机设计资料的方差分析，SPSS13．0软件进行统计学处理。 结果: 1、大体观察对照组肠管呈粉红色，质地柔软，有光泽。IIRI组肠系膜上动脉夹闭后，由该动脉供血的肠管颜色变暗，呈紫色，失去光泽。 2、光镜下见对照组小鼠肠道黏膜各层结构正常，绒毛排列整齐；IIRI6h组改变不明显，12h组绒毛萎缩变短、水肿，24h组绒毛严重受损，脱落明显，排列紊乱，隐窝结构密集，间质明显水肿，炎性细胞浸润，48h组绒毛长短不一，排列不整齐，隐窝结构较前稀疏，间质充血不明显，其中以24h组肠道损伤表现最为明显。 3、免疫组织化学结果显示，在正常的对照组小肠组织中，msi-1主要表达在小肠隐窝底部，潘氏细胞上面，与对照组相比，IIRI组msi-1表达增加，各组阳性细胞比例显著增高（0．062±0．008；0．088±0．014；0．134±0．017；0．090±0．011 vs，0．021±0．003，P<0．01）； 24h表达最强，随时间延长，msi-1的表达减弱，至48h时与对照组相比（0．090±0．011）；在正常小肠组织中PCNA主要表达于肠隐窝中上部的细胞核内，而在隐窝基底部表达较少，肠IIRI损伤后，PCNA表达开始减弱，但IIRI6h时PCNA指数改变不明显（0．79±0．072 vs．0．84±0．095，P>0．05），IIRI12h时PCNA开始指数下降（0．69±0．090 vs．0．84±0．095，<0．01），IIRI24h表达最弱（0．51±0．058 vs．0．84±0．095，P<0．01），IIRI48h又有增强（0．63±0．059 vs．0．84±0．095，P<0．01）。对IIRI损伤后，小鼠小肠黏膜破坏，绒毛隐窝结构萎缩：免疫组织化学结果发现：与空白对照组相比，IIRI损伤组msi-1 mRNA表达增高，msi-1阳性细胞指数显著增高；至损伤后24h达到最高，48h又下降； RT-PCR也显示msi-1 mRNA的类似表达情况。 结论: msi-1可作为肠上皮干细胞的一种标记物，可用来观察肠黏膜损伤修复过程中肠上皮干细胞的动态变化，msi-1阳性细胞可能对IIRI所致肠黏膜损伤起着一定的损伤修复作用。PCNA可反映细胞的增殖状态，一定程度上反映肠道干细胞的增殖潜能，对其检测可反映肠黏膜上皮损伤修复状况。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

材料和方法

1.主要试剂盒仪器

1.1主要试剂

1.2主要仪器

2.实验动物模型的建立和标本的取材

2.1实验动物

2.2模型制作

2.3标本取材

3.检测指标与方法

3.1小肠组织病理检测

3.2小肠组织PCNA，msi-1免疫组化的测定

3.3小肠组织musahsi-1 mRNA表达量的测定

4.统计学方法

实验结果

1.动物及标本的大体观察

2.肠黏膜病理改变

3.肠IIRI损伤时肠黏膜musahsi-1的表达结果

3.1 肠IIRI损伤时msi-1蛋白在小肠隐窝中的免疫组化染色

3.2 肠IIRI损伤时msi-1 mRNA在小肠隐窝中表达结果

4.IIRI损伤时PCNA在小肠隐窝中的表达结果

讨论

结论

参考文献

附录

发表论文及参研课题

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明