AT富集序列特异性结合蛋白1促进前列腺癌细胞增殖和侵袭的实验研究

摘要

本研究的目的是探讨和评估SATB-1对前列腺癌生物学行为的影响，以及阐明该变化是否通过上皮细胞-间充质细胞(EMT)转化途径实现。本研究旨在通过检测SATB-1在前列腺癌、及癌旁组织和典型前列腺细胞系中的表达，探讨其与前列腺癌侵袭、转移等特性的关系。
　　本课题研究内容分三个部分
　　第一部分: SATB-1在前列腺癌组织和前列腺细胞系中表达的实验研究
　　目的:通过本实验明确SATB-1在前列腺癌组织以及前列腺细胞系中的表达情况，为后续的研究提供形态学依据和实验材料。
　　方法:
　　1)标本收集:2010年12月和2014年11月间在南方医科大学接受前列腺癌手术治疗的98例患者的前列腺癌组织和癌旁组织。
　　2)细胞系选用与细胞培养:前列腺癌PC3、LNCaP、22RV1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，USA)，分别保存于RPMI1640溶液中，定期补充含10％（体积/体积）胎牛血清和抗生素。DU145细胞系使用改良伊格尔培养基，定期补充含10％（体积/体积）胎牛血清、2毫摩尔的L-谷氨酰胺和抗生素。人类非致瘤性前列腺上皮细胞系RWPE-1在无血清培养基中培养，补充5毫微克/ml人重组表皮生长因子和30mg/ml牛垂体提取物（Invitrogen，加利福尼亚州）。培养细胞系维持37℃，5％CO2的潮湿环境。
　　3)免疫组化:对于SATB-1表达的免疫组织化学分析，使用自动切片，厚度4um，自动染色系统预处理，用抗SATB-1抗体标记(Abcam公司)。至少有1％癌细胞中出现任何强度的核阳性，被认为SATB-1阳性表达。在任何原发性肿瘤或淋巴结转移的细胞核阳性病例被认为是阳性表达，间质淋巴细胞作为SATB-1的阳性对照。
　　4)RNA提取和实时定量PCR测定:根据试剂操作(Invitrogen，USA)的说明，从冷冻组织样品、细胞系，使用Trizol试剂提取总RNA并纯化。定量RT-PCR使用随机引物和反转录试剂盒(Takara，China)。在20微升的反应体积中，从总RNA逆转录cDNA。反转录在37℃下进行15分钟，然后在85℃维持5秒。使用Power SYBR Green(Takara，China)系统的标准流程进行实时定量RT-PCR分析。所有的操作均按照说明要求完成，并进行标准化对照。
　　5)引物合成:引物由上海生工生物工程技术服务公司（上海，中国）合成。基因特异性引物为SATB-1的序列（正向，5'GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3';反向，5'-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3'）和GAPDH（正向，5'-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3';反向，5'-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3-'）。使用ABI7500平台进行定量RT-PCR测定和数据收集，每个样品一式三份进行分析。
　　6)Western Blot印迹分析:使用哺乳动物细胞全蛋白提取试剂盒RIPA(碧云天)，补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和PMSF(Roche)的裂解产物。蛋白质通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并转移至0.22毫米硝化纤维素(NC)或聚偏二氟乙烯膜上(Sigma)。将膜洗涤、固定，并且与特定的初级抗人抗体温育。SATB-1抗体购自Abcam公司（Cambridge，USA），二级抗体是辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG。底物显色及条带的强度通过Bio-Rad公司定量分析软件进行光密度测定的定量分析。
　　结果:通过免疫组化检查、定量RT-PCR和免疫印迹分析98对PCa的组织样本和癌旁组织样本的SATB-1的表达水平，比较后发现，SATB-1的表达在癌组织与癌旁组织出现显著上调。进一步的观察表明，SATB-1蛋白主要位于细胞核中。在77/98(78.57％)例前列腺癌病例中观察到SATB-1的阳性染色，在相邻的癌旁组织标本中阳性表达的比例为18/98(18.36％)，但两者有显著统计学意义(P＜0.001)。
　　结论:定量RT-PCR和免疫印迹的结果表明，肿瘤组织比癌旁组织表现出更高水平的SATB-1 mRNA和蛋白质。此外，我们研究了在前列腺细胞系以及永生化非致瘤性人前列腺上皮细胞系RWPE-1 SATB-1的表达。相比RWPE-1细胞系，SATB-1的mRNA和蛋白水平在所有人类前列腺癌细胞系大大升高。SATB-1的表达水平在不同前列腺细胞系之间有一定差异。
　　第二部分:SATB-1促进前列腺癌细胞增殖的实验研究
　　目的:探讨SATB-1对前列腺癌细胞增殖的影响
　　方法:
　　1)细胞转染:SATB-1表达载体选用pcDNA3.1，构建沉默SATB-1的特异性shRNA pGenesil2-SATB-1，选用lipofectamin转染细胞(Invitrogen，USA)。转染后，孵育24小时，然后用G418筛选（400毫克/毫升）稳定转染克隆。其后，挑选稳定的细胞单菌落，并在含有200毫克/毫升G418的培养基上进一步培养。所有后续研究使用的稳定细胞系均从单菌落进行培养。用pcDNA3.1或pGenesil2载体转染的细胞作阴性对照。
　　2) MTT法:转染成功后，将细胞在96孔板中用104细胞/孔的密度接种。此后，更换培养基，细胞用20微升的MTT(5mg/ml; Sigma)培养4小时。该混合物以12，000转/min在4℃下进行10分钟离心。除去上清液，加入50微升的DMSO到每个孔中，并且将溶液搅拌均匀后上脱色摇床10分钟。用酶免疫分析仪(BioTek)测定每个孔在490nm的光密度(OD)值。
　　3)细胞增殖的抑制率(抑制率，IR)的计算如下:IR=（1-实验组的平均OD值/对照组的平均OD值）×100％。使用不同浓度的细胞增殖抑制率，计算50％抑制浓度(IC50)。
　　结果:LNCaP细胞被用来建立SATB-1过表达的细胞系，并用DU145细胞系通过病毒转染，建立SATB-1沉默细胞系。SATB-1的过度表达（指LNCaP-SATB-1）和沉默SATB-1表达（指DU145-shSATB-1），细胞系中的表达水平通过qRT-PCR和Western印迹验证。在LNCaP-SATB-1细胞系，SATB-1 mRNA的定量RT-PCR显示表达水平与对照组相比有显著增加;蛋白质印迹显示SATB-1蛋白在LNCaP-SATB-1细胞中的表达显著增高;与对照组相比，在DU145-shSATSATB-1细胞系，mRNA的定量RT-PCR显示表达水平显著降低;蛋白质印迹显示DU145-shSAT SATB-1细胞系蛋白的表达降低显著。
　　结论:通过MTT研究表明，LNCaP-SATB-1细胞系与对照相比，细胞增殖显著增加;与此相反，DU145-shSATB-1细胞系细胞增殖的比例较低。因此，研究认为SATB-1表达影响前列腺细胞增殖。
　　第三部分:SATB-1调控前列腺癌细胞迁移和侵袭的实验研究
　　目的:探讨SATB-1对体外Transwell小室前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响
　　方法:Transwell小侵袭实验:细胞侵袭实验使用8毫米孔径Transwell小室，将悬浮于无血清培养基的转染后细胞接种到上部室，补充有10％FBS的置入下室。经过24小时后，已通过膜表面侵入的细胞用甲醇固定，用结晶紫染色10分钟，并计数，测定侵袭结果。
　　结果:进行迁移和侵袭实验研究结果表明，经过沉默SATB-1处理的DU145-细胞与LNCap SATB-1表达组相比，其迁移和侵袭能力显著减少。pcDNA3.1载体空转染组和对照组之间无显著差异。
　　结论:前列腺癌细胞系的体外研究证实，在LNCaP细胞的SATB-1表达，能促进他们的迁移和侵袭能力。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景和目的

1．2 前列腺癌治疗方式的演化

1．3 SATB-1的生物学特点

1．4 EMT过程在肿瘤转移中的作用

1．5 SATB-1在前列腺癌领域的研究构想

第二章 SATB-1在前列腺癌组织和细胞系表达的实验研究

2．1 实验材料与设备

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 实验结论

第三章 SATB-1促进前列腺癌细胞增殖的实验研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 研究结果

3．4 研究结论

第四章 SATB-1调控前列腺癌细胞迁移和侵袭的实验研究

4．1 实验材料与设备

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 研究结论

第五章 研究结论

第六章 全文小结

参考文献

缩写词简表

致谢

博士研究生期间发表论文情况

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