脑摄取平衡时丙泊酚对犬脑不同区域兴奋性氨基酸转运体EAAT2 mRNA的影响

摘要

静脉全麻药物丙泊酚因具有起效快、持续时间短、代谢迅速、术后恶心呕吐发生率低等优点，目前被广泛应用于临床麻醉的诱导、维持以及重症病人的镇静，但其中枢作用机制尚未完全阐明。研究表明，兴奋性神经递质和抑制性神经递质的释放和传递在全麻药物作用机制中发挥着重要作用。因此，进一步探讨丙泊酚对不同脑区神经递质的影响有助于揭示其中枢作用机制。
　　 谷氨酸(glutamate acid)是哺乳动物中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质，参与痛觉传导、中枢过敏、学习记忆、神经生长等重要的生物学效应。它是中枢神经系统中含量最多的兴奋性递质，一旦发生调节障碍就可能会导致神经毒性。星形胶质细胞摄取谷氨酸能够终止谷氨酸能神经传递，以防止胞外谷氨酸浓度过高对中枢神经系统产生毒性，但叔丁基过氧化氢能够抑制机体的这种保护机制。应用丙泊酚可以防止和逆转叔丁基过氧化氢对星形胶质细胞的影响，这或许可以避免突触外谷氨酸病理性增加，从而延缓或阻止兴奋性神经元的死亡。然而神经胶质细胞外的谷氨酸代谢酶系统对谷氨酸含量影响甚微，突触间隙谷氨酸浓度的调节主要依赖于谷氨酸转运体。谷氨酸转运体分高亲和力转运体，即兴奋性氨基酸转运体（EAATs）和低亲和力转运体，即囊泡谷氨酸转运体(VGLUTs)两种类型，目前已知的位于细胞膜的EAATs有5种，其中主要在星形胶质细胞上表达的兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2，在啮齿类动物又称为GLT-1)能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸，中止谷氨酸能神经递质传递，与脑中大部分谷氨酸的摄取密切相关。病理状态下星形胶质细胞上EAAT2功能及表达会发生异常，这将导致细胞外谷氨酸异常堆积，许多神经系统的疾病可能与此密切相关。SD大鼠鞘内注射EAAT2选择性抑制剂DHK能够增加异氟醚的MAC值。临床浓度下的异氟醚(1％～3％)还能以时间、钠离子和浓度依赖的方式增强原代培养大鼠脑神经元中GLAST和GLT-1的最大转运速率(Vmax)及配体亲和力（Km）。浓度在1～1000μmol之间的局部麻醉药利多卡因和布比卡因均不改变谷氨酸诱导出的内向电流，而浓度为0.3～300μmol的静脉麻醉药硫喷妥钠和氯胺酮对GLT-1转运功能的影响也十分微弱。但在缺血缺氧状态下，GLT-1能够逆向转运谷氨酸，此时咪唑安定和氯胺酮可以发挥脑保护作用，减弱其逆向转运作用，但未发现硫喷妥钠和丙泊酚具有这种保护作用。临床浓度下的丙泊酚和非特异性NMDA受体拮抗剂MK-801对细胞的缺血保护作用相当，但不能被GLT-1拮抗剂阻断。这表明，丙泊酚的缺血保护作用不是通过谷氨酸转运体发挥作用的。研究发现，GLT-1的表达对缝隙连接具有依赖性，而丙泊酚作为缝隙连接阻断剂能够抑制GLT-1的表达。这些结论表明，多种麻醉药物对中枢神经系统状态的影响均与EAAT2密切相关。
　　 丙泊酚的全麻作用可能与某些特殊区域脑组织有关。我们前期研究表明，脑摄取平衡时，丙泊酚在犬脑不同区域呈均衡分布，不同麻醉深度的丙泊酚可影响犬脑不同脑区谷氨酸的表达:深麻醉状态下各脑区谷氨酸浓度较浅麻醉状态明显降低，其中下丘脑谷氨酸变化率明显高于其他脑组织。
　　 本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术，进一步观察不同麻醉深度丙泊酚恒速输注50min脑摄取平衡时，丙泊酚对犬脑各区域（下丘脑、底丘脑、背侧丘脑、海马、脑桥、项叶以及额叶）EAAT2 mRNA的影响，以探讨不同麻醉深度丙泊酚对不同脑区兴奋性氨基酸转运体的中枢作用。
　　 材料和方法：
　　 1动物准备与分组
　　 18只健康杂种犬，雌雄不限，年龄12～18个月，体重10～12kg，由南方医科大学动物实验中心提供。随机分为对照组（C组）、低剂量组（L组）和高剂量组（H组），每组6只。实验均安排在上午8:00至12:00进行。实验前禁食、水12小时，经右后肢大隐静脉开放外周静脉通路。
　　 2麻醉管理
　　 C组:经右后肢大隐静脉快速推注10％KCl2mg/kg处死。
　　 L组:诱导时经右后肢大隐静脉注入丙泊酚5.5mg/kg，注射时间为15s。续以55mg/kg/h恒速静脉输注丙泊酚50min维持麻醉。
　　 H组:诱导时经右后肢大隐静脉注入丙泊酚7.0mg/kg，注射时间为15s。续以70mg/kg/h恒速静脉输注丙泊酚50min维持麻醉。
　　 待两组动物达到预定麻醉深度（眼睑反射及踏板反射消失）后，经口插入ID9.0号气管导管，固定并连接呼吸机，吸入纯氧，调节呼吸频率每分钟15～20次，潮气量15ml/kg，使呼气末二氧化碳分压(PETCO2)维持在30～38mmHg，犬尾尖端接指套监测SpO2，使SPO2＞95％。以20G肝素化套管针行右股动脉穿刺，接BeneView T8多参数监护仪检测平均动脉压(MAP)和脉率(PR)。
　　 3标本采集
　　 丙泊酚恒速输注50min时，两组分别取颈内动、静脉血各2ml，注入含枸橼酸钾抗凝液的真空采血管内，充分混匀，-4℃冰箱中保存。两组均静脉推注10％的KCl注射液2mg/kg处死动物，无菌条件下分离并获取下丘脑、底丘脑、背侧丘脑、海马、脑桥、顶叶以及额叶组织(0.15～0.3g)，剔除血管与软脑膜，用蒸馏水冲洗血迹，置于无菌干燥EP管中，于-80℃超低温冰箱中保存待检。
　　 4血浆丙泊酚浓度测定
　　 抗凝的血样品于4℃下以3500r/min离心10min分离血浆。取血浆200μl于EP管，加入乙腈400μl用涡旋器震荡2min，10000r/min再离心10min，取上清液20μl。以高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)测量血浆丙泊酚浓度。
　　 高效液相色谱条件:色谱柱（Shim-pack VP-ODS，250nm×4.6mmID），保护柱(Shim-pack GVP-ODS，10mm×4.6mmID)，流动相A为纯水，流动相B为甲醇，A∶B为15∶85，自动进样量20μl，柱温:4℃，流速1ml/min，检测波长270nm。所用试剂为分析纯。
　　 5脑区筛选
　　 在选择待测指标时采用混合样品检测法(PDT)，即将同组的6只实验犬取同一脑区的的脑组织等质量混和，总量0.1g。3组动物7个脑区共得到21个混合组织标本，应用qRT-PCR检测混合样本中EAAT2 mRNA的表达水平，筛选出组间表达差异显著（差异倍数＞2）的脑区做进一步的检测。
　　 6脑组织EAAT2 mRNA含量测定
　　 采用qRT-PCR方法检测各脑区EAAT2 mRNA的表达水平。
　　 6.1总RNA提取与反转录
　　 Trizol法提取各组总RNA后按照Takara公司RNA反转录试剂盒说明书进行反转录(RT)，反应体系:5×Buffer2μl，AMV逆转录酶1μl，dNTP0.5μl，随机引物1μl，DEPC水4.5μl，RNA1μl，共10μl。RT反应条件为42℃30min，100℃3min，反应在PCR扩增仪中进行，反应产物cDNA置-20℃保存。
　　 6.2 qRT-PCR检测
　　 根据GenBank提供的EAAT2基因序列(NC_006600)和mRNA设计原则，应用引物设计软件Primer Premier5.0设计引物并交由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。qRT-PCR检测采用SYBR Green I染料法，反应体系如下:总体积25μl，其中含SYBR Green PCR Master Mix12.5μl，目的基因上游引物0.5μl，目的基因下游引物0.5μl，DEPC水10.5μl，cDNA模板1μl。反应条件:95℃预变性10min;95℃10s，60℃30s，共40个循环，循环结束后进行熔解曲线分析。所有反应重复均3次。
　　 6.3数据处理
　　 以2-△△CT值表示L组和H组基因的相对表达量，△CT=CT待测基因-CT内参基因，△△CT=△CT实验组（L组或H组）-△CT对照组（C组）。
　　 7统计方法
　　 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。L组、H组颈内动、静脉间血浆丙泊酚浓度比较采用配对t检验，两组之间颈内动脉丙泊酚血浆浓度的比较及颈内静脉丙泊酚血浆浓度的比较采用独立样本t检验。三组间同一脑区EAAT2 mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析，满足方差齐性的多重比较采用LSD法，不满足方差齐性的多重比较采用Tambane's法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1一般情况
　　 三组实验犬年龄、体重、性别均无显著性差异，L组和H组实验动物均安全迅速达到预定麻醉状态并维持稳定，无呛咳、呕吐等不良反应，平均动脉压和脉搏在犬正常生理值范围内波动。L组MAP(77.00±6.90)mmHg，PR(115.50±5.17)次/min，H组MAP（54.17±5.98）mmHg，PR（89.00±4.10）次/min，两组间差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2犬颈内动、静脉丙泊酚血浆浓度
　　 L组颈内动、静脉血浆丙泊酚浓度分别为3.18±0.06μg/ml和3.12±0.09μg/ml，差异无统计学意义(P＞0.05);H组颈内动、静脉血浆丙泊酚浓度分别为6.21±0.07μg/ml和6.14±0.11μg/ml，差异无统计学意义(P＞0.05)。两组之间丙泊酚血浆浓度（动脉-动脉，静脉-静脉比较），差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 3 qRT-PCR产物的特异性检验
　　 qRT-PCR扩增产物的熔解曲线分析结果显示为单一尖锐峰，无引物二聚体，扩增效率大于95％。
　　 4脑区筛选
　　 与C组比较，在下丘脑、海马、顶叶和背侧丘脑四个脑区L组和H组的EAAT2rnRNA表达差异显著且一致性较好，其余脑区差异不明显。
　　 5 EAAT2 mRNA相对表达量
　　 下丘脑L组和H组EAAT2 mRNA的相对表达量分别为C组的（2.14±0.69）和(2.04±0.73)倍;
　　 海马L组和H组EAAT2 mRNA的相对表达量分别为C组的（1.83±0.58）倍和(2.42±0.87)倍;
　　 顶叶L组和H组EAAT2 mRNA的相对表达量分别为C组的（1.60±0.41）和(1.59±0.23)倍。
　　 下丘脑、海马以及顶叶的L组、H组与C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但L组和H组之间比较无明显差异(P＞0.05)。
　　 背侧丘脑EAAT2 mRNA的相对表达量三组之间比较均无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.丙泊酚恒速静脉输注50min时，犬脑对丙泊酚的摄取达到平衡状态。
　　 2.脑摄取平衡时丙泊酚可显著上调下丘脑、海马和顶叶EAAT2 mRNA的表达，但不同剂量对其表达的影响无显著差异。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料和方法

1 主要试剂和药品

2 主要仪器设备

3 实验动物来源

4 动物准备与分组

5 麻醉实施

6 标本采集

7 血浆丙泊酚浓度测定

8 脑区筛选

9 脑组织EAAT2 mRNA含量测定

10 统计学分析

第三章 结果

1 生命体征

2 丙泊酚血浆浓度变化

3 脑区筛选结果

4 EAAT2 mRNA相对表达量

第四章 讨论

一、丙泊酚麻醉作用的脑区特异性

二、不同脑区的选择依据

三、谷氨酸转运体及其基本功能

四、EAAT2的脑区差异性

五、麻醉药物对EAAT2的影响

六、丙泊酚脑摄取平衡状态与EAAT2表达

第五章 结论

参考文献

综述 兴奋性氨基酸转运体的研究进展

缩略词表

成果

附图

致谢

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