新月弯孢霉抗性菌株选育及P450酶特性分析

摘要

本实验研究了新月弯孢霉细胞色素P450酶与甾体11β-羟基化的关系,选育具有酮康唑抗性标记的氢化可的松高产菌株KA-91,并对其发酵条件工艺优化.主要研究内容和结果如下:1、通过CO差光谱法检测到新月弯孢霉细胞中存在P450酶.苯巴比妥钠和过氧化物酶增殖剂邻苯二甲酸异辛酯以及RSA均对P450酶具有诱导作用.酮康唑对P450酶具有抑制作用.P450酶含量与氢化可的松的生成具有正相关性.2、确立了新月弯孢霉原生质体的适宜形成与再生条件:将培养22h的菌丝用0.3mol/L的二硫苏糖醇处理20min,0.6mol/L的KCl作为渗稳剂,30℃条件下经0.5﹪新生酶234和1﹪纤维素酶混合液(pH5.6)酶解3h,原生质体释放量达到7.76×10<'6>个/mL,再生率为23.07﹪.再生菌株菌落形态不变,保留了甾体11β-羟基化能力.3、采用NTG和紫外线复合诱变,结合酮康唑抗性筛选法,选育出氢化可的松高产菌株KA-91,氢化可的松转化率达到63.05﹪.将菌株KA-91连续5次转接斜面,发现菌株遗传性能稳定.4、确立了KA-91生产氢化可的松的适宜摇瓶分批发酵条件:发酵培养基为葡萄糖22g/L,牛肉膏5g/L,酵母膏4g/L;初始和转化pH6.5;装液量30mL/250mL三角瓶;摇瓶转速0~6h:160 r/min;6~68h:200r/min;发酵温度28℃;发酵周期72h.采用改进工艺和最适投料方法,RSA投料浓度为1.0g/L时,氢化可的松转化率达到74.88﹪.以适宜摇瓶分批发酵条件为基础,对氢化可的松高产菌KA-91进行了7L罐分批发酵试验,发酵周期68h,氢化可的松转化率达到77.92﹪.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1甾体化合物概述

1.1.1甾体化合物的结构、分类与临床应用

1.1.2甾体化合物的存在形式

1.1.3甾体化合物的作用

1.2甾体化合物的生物转化

1.2.1甾体化合物微生物转化研究发展史

1.2.2甾体生物转化反应类型

1.3微生物的甾体11β-羟基化反应研究进展

1.3.1微生物的甾体11β-羟基化反应

1.3.2氢化可的松的结构、性质及其作用

1.3.3 11β-羟基化反应的微生物菌种

1.3.4 11β-羟基化反应的底物与产物多样性

1.3.5 11β-羟基化反应的转化工艺及技术

1.3.6底物的溶解性与投料方式

1.3.7 11β-羟化酶的结构与作用机理

1.4本课题的立题依据

1.4.1国内外甾体医药工业的现状及发展趋势

1.4.2国内外氢化可的松生产研究现状

1.5本论文的研究内容

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌种

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1甾体转化实验

2.2.2原生质体的制备与再生

2.2.3诱变育种及抗性突变株筛选方法

2.2.4在羟化过程中P450酶活性研究

2.2.5 7L罐放大实验

第三章结果与讨论

3.1新月弯孢霉P450酶的研究

3.1.1新月弯孢霉P450酶含量检测

3.1.2细胞色素P450酶的诱导

3.1.3酮康唑对细胞色素P450酶的抑制作用

3.1.4氢化可的松转化过程中P450酶含量的变化

3.2底物RSA预诱导发酵工艺的研究

3.2.1预诱导RSA添加时间的选择

3.2.2预诱导RSA浓度对P450酶表达影响

3.2.3 RSA预诱导对氢化可的松产量的影响

3.3新月弯孢霉原生质体的制备与再生

3.3.1原生质体的制备

3.3.2原生质体稳定性的研究

3.3.3原生质体的形成过程

3.3.4原生质体的再生

3.3.5原生质体再生菌株生产能力测试

3.4原生质体诱变选育酮康唑抗性突变株

3.4.1 CL-114菌株的酮康唑最小抑制浓度

3.4.2 NTG诱变及酮康唑抗性突变株的选育

3.4.3紫外线诱变及酮康唑抗性突变株的选育

3.5新月弯孢霉KA-91发酵条件的优化

3.5.1摇瓶发酵条件的优化

3.5.2 7L罐放大试验

第四章结论

第五章展望

参考文献

致谢

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