缺血后处理减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤及其增强干细胞治疗心肌梗死效果

摘要

目的：本研究旨在探讨：(1)缺血后处理是否通过阻断线粒体渗透性转换减轻心肌细胞凋亡及超微结构损伤；(2)在心肌梗死后、再灌注前，对远隔的另一心肌区域进行短暂、反复非梗死性缺血，能否减轻缺血／再灌注损伤，及其可能机制；(3)缺血后处理减轻缺血／再灌注损伤、调控心肌微环境，能否进而增强移植干细胞的存活及修复梗死心肌的能力，及其可能机制。 方法：(1) SD大鼠给予麻醉、开胸，结扎左主冠状动脉(LCA)30min，之后持续再灌注5min或120min，随机分为8组(n=12)：假手术组，未予缺血；对照组，未予其它处理；缺血后处理组，于再灌注前给予3个循环的10秒再灌注及10秒缺血；缺血预处理组，于30min缺血前给予3个循环的5min缺血及5min再灌注；其余4组给予线粒体渗透性转换孔阻断剂环孢霉素A或开放剂苍术苷。TTC法检测心肌梗死面积。电镜观察超微结构。分光光度法检测线粒体渗透性转换。TUNEL法检测细胞凋亡。(2)SD大鼠给予结扎LCA30min，之后持续再灌注120min，随机分为6组(n=8)：对照组；心脏内远隔缺血后处理组，于开放LCA前，对冠状动脉旋支进行3个循环的结扎10秒及开放10秒；苍术苷组，静脉给予苍术苷；心脏内远隔缺血后处理+苍术苷组：经典缺血后处理组；假手术组。检测心肌梗死面积、心肌细胞超微结构。血流动力学法检测心脏功能，分光光度法检测炎症反应。(3)贴壁培养法获取SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，使用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒进行标记。SD大鼠给予结扎LCA30min，之后持续再灌注72小时或28天，随机分为5组(n=16)：对照组；缺血后处理组；单纯干细胞移植组，于再灌注120min，经心肌局部注射GFP标记的BMSCs；缺血后处理+干细胞移植组；假手术组。移植70小时(再灌注72小时)，酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫组化法检测炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β及抗炎因子IL-10表达；Western-blot及Real-time PCR法检测抗凋亡因子BCL-2及促凋亡因子BAX表达。移植70小时及28天，免疫荧光染色法检测存活的GFP阳性的BMSCs及其分化。移植28天，Real-time PCR及Westem-blot或免疫组化法检测旁分泌因子血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达；免疫组化法检测血管再生；Masson染色法检测胶原沉积；超声心动图法检测心脏功能。 结果：(1)与对照组比较，缺血后处理、环孢霉素A及缺血预处理组心肌梗死面积明显缩小，代表线粒体渗透性转换程度的540nm光密度值下降百分比明显降低(20.2％±2.3％vs.12.1％±1.8％，11.2％±3.3％，12.1％±5.6％，P＜0.01)，线粒体评分更低(2.09±0.27 vs.1.27±0.27.0.97±0.26，1.28±0.32，P＜0.01)，细胞凋亡指数更小(34.9％±2.6％vs.17.5％±1.7％，17.6％±2.1％，17.2％±2.1％，P＜0.01)。苍术苷能阻断、而环孢霉素 A未能增强缺血后处理的心脏保护作用。(2)与对照组比较，持续再灌注结束时，心脏内远隔缺血后处理组及经典缺血后处理组心肌梗死面积缩小(49.1％±5.2％vs.32.0％±5.5％，26.4％±5.0％，P＜0.05)，左室±dP/dtmax增高(+dP/dtmax，5983±620mmHg/svs.6938±690mmHg/s，6897±810mmHg/s，P＜0.05；-dP/dtmax，5408±655mmHg/s vs.6235±649mmHg/s，6139±620mmHg/s，P＜0.05)，超微结构损伤减轻，血浆及缺血心肌组织丙二醛活性降低、超氧化物岐化酶活性增高，缺血心肌组织髓过氧化物酶活性降低。苍术苷阻断心脏内远隔缺血后处理的心脏保护作用。(3)与对照组比较，再灌注早期(72小时)，缺血后处理组、单纯干细胞移植组及缺血后处理+干细胞移植组降低炎症及促凋亡因子水平，增强抗炎及抗凋亡因子表达，缺血后处理+干细胞移植组的有益作用强于单纯干细胞移植组(P＜0.05)。缺血后处理+干细胞移植组无论是移植70小时还是28天，GFP阳性细胞数均显著高于单纯干细胞移植组(移植70小时，90士14/mm2 vs。61±12/mm2，P＜0.01；移植28天，55±14/mm2 vs.26±8/mm2，P＜0.01)；没有发现GFP阳性细胞向心肌细胞分化。移植28天，缺血后处理组、单纯干细胞移植组及缺血后处理+干细胞移植组心功能高于对照组(左室射血分数，LVEF，69％±6％，75％±4％，82％±4％vs.62％±8％，P＜0.05)，缺血后处理+干细胞移植组与单纯干细胞移植组之间LVEF存在差异(P＜0.05)。单纯干细胞移植组及缺血后处理+干细胞移植组生长因子表达、梗死区域毛细血管密度均高于对照组(P<0.01)，两组之间也均存在差异(P<0.01)。相对于对照组，缺血后处理组、单纯干细胞移植组及缺血后处理+干细胞移植组阻断胶原沉积及MMP-9表达，增强TIMP-1表达：缺血后处理+干细胞移植组的上述作用较缺血后处理组及单纯干细胞移植组更强(P<0.05)。 结论：(1)阻断线粒体渗透性转换可能参与缺血后处理减轻心肌细胞凋亡及超微结构损伤。(2)心脏内远隔缺血后处理缩小心肌梗死面积，减轻缺血／再灌注损伤，阻断线粒体渗透性转换孔的开放可能参与这种心脏保护作用。(3)缺血后处理通过减轻缺血／再灌注损伤、调控心肌微环境，可以进而增强移植干细胞的存活及修复梗死心肌的能力，旁分泌机制在干细胞治疗中发挥可能更为重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前言

第一部分缺血后处理减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤及其机制

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分心脏内远隔缺血后处理减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤及其机制

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分缺血后处理增强干细胞治疗大鼠心肌梗死效果及其机制

材料与方法

结果

1 大鼠BMSCs生物特征

2 在体实验动物存活情况

3 缺血后处理对BMSCs移植早期心肌梗死微环境的改善作用

4 缺血后处理对移植早期及晚期BMSCs存活与分化的影响

5 缺血后处理基础上BMSCs移植对心功能的影响

6 缺血后处理对移植晚期BMSCs旁分泌因子表达的影响

7 缺血后处理基础上BMSCs移植对血管再生的影响

8 缺血后处理基础上BMSCs移植对心肌纤维化及其相关因子表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述一 缺血后处理的心脏保护作用及其信号通路

综述二 干细胞移植治疗心肌梗死的研究现状

博士期间发表论文

致谢