人类杯状病毒的pET-28a(+)-SVA构建及高效表达和LAMP法检测

摘要

人类杯状病毒(Human caliciviruses，HucV)包括诺如病毒属(NV)和札如病毒属(SV)，是导致胃肠炎和病毒性腹泻的重要病毒之一。目前分离和研究较多的是NV，而SV国内基础研究资料的匮乏，给病毒的检测和疫苗的研制带来了很多困难。本课题研究工作的目的在于：构建SV原核表达载体，并以此为代表表达人类杯状病毒衣壳蛋白，同时建立环介导等温扩增技术检测方法。对认识病毒感染的本质，快速诊断，研制疫苗以及抗病毒药物提供重要的基础资料，对了解婴幼儿腹泻的发病机制及疾病的预防具有重大的指导意义。 本课题包括两个部分：一是对人类杯状病毒衣壳基因序列进行人工合成、然后克隆构建原核表达载体，并表达。二是建立环介导等温扩增技术检测人类杯状病毒的方法。 一、设计引物，人工合成SV衣壳基因，TA克隆后测定其核苷酸序列。将其定向克隆入pET-28a(+)载体，构建新的原核表达载体，经菌落PCR和酶切鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过适当的培养基组成、接种量、诱导OD值、IPTG浓度和诱导时间等因素表达SV衣壳蛋白。最后，收集菌体，破菌，离心，分离上清和包涵体。SDS-PAGE显示，目的蛋白主要以包涵体形式存在。Western-blotting结果显示，SV蛋白能够特意地与六组氨酸抗体发生免疫反应，在15kd处有一条明显的条带。 二、环介导等温扩增(简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。本实验建立了环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测人类杯状病毒的方法，该方法与传统PCR方法相比，LAMP方法具有灵敏度高，特异性强，操作简便快速，不需要复杂仪器设备等优点，为临床检测腹泻病毒快速简便的新方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

第一节人类杯状病毒研究现状及意义

1.人类杯状病毒的分类和命名

2.人类杯状病毒的分子生物学特征

3.人类杯状病毒分子流行病学研究概况

4.人类杯状病毒的疫苗研究现状

5.人类杯状病毒的检测方法

第二节环介导等温扩增技术(LAMP)

1.环介导等温扩增技术简介

2.LAMP反应引物设计

3.LAMP反应原理(图1-2)

4.LAMP反应特点

5.LAMP技术的应用

第三节课题研究的意义及前景

第一章札如病毒的pET-28a(+)-SVA的构建

第一节前言

第二节材料与方法

1.材料

2.方法

第三节结果与讨论

1.pET28a(+)-SVA载体构建原理(见图1-1):

2.人工合成SVA基因序列

3.SVA基因序列的PCR扩增

4.SVA基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

5.SVA基因片段的TA克隆和克隆质粒测序

6.酶切pET28a(+)和克隆质粒pMD19-T-SVA

7.表达质粒pET28a(+)和SVA基因片段的连接和转化

8.重组表达质粒的菌落PCR及酶切鉴定

9.重组表达质粒测序及分析

第四节结论

第二章SVA基因蛋白的表达和鉴定

第一节前言

第二节材料与方法

1材料

2方法

第三节结果与讨论

1.SVA基因片段的诱导表达

2.SVA蛋白的SDS-PAGE电泳检测

3.Western blotting

第四节结论

第三章环介导等温扩增(LAMP)检测人类杯状病毒

第一节前言

第二节材料与方法

1.材料

2.方法

第三节结果与讨论

1.LAMP反应引物示意图及其基因扩增结果

2.LAMP反应条件优化

3.LAMP反应特异性

4.LAMP法检测的灵敏度

5.显色反应

6.LAMP法和RT-PCR法检测诺如病毒的结果比较

7.LAMP法检测札如病毒结果

第四节结论

第四章结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历