山麻鸭睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化与性质研究

摘要

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephacryl S-300分子筛柱，从山麻鸭睾丸中提取出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，EC3.3.1.52，简称NAGase)，比活力为5537.00 U/mg。提取的酶液经PAGE检测，呈现一条蛋白条带，经SDS-PAGE平板电泳呈现1种蛋白条带，亚基分子质量为67.60kD，等电点为5.05。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)为底物，进行酶催化底物水解的反应动力学研究，结果表明：山麻鸭睾丸NAGase催化底物反应的最适pH是5.70，在pH3.0～8.43区域较稳定；最适温度分别为45℃，酶活力在5℃～45℃的范围内保持稳定。睾丸NAGase水解pNP-NAG的反应符合米氏双曲线方程，水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.17 mmol/L，最大反应速度Vm为8.82μmol/L/min，反应的活化能为57.57 kJ/mol。 研究金属离子对睾丸NAGase的影响，结果表明：低浓度(1～20mmol/L)的Na+对酶有激活作用。K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高浓度(0.02～1 mol/L)Na+对酶活力有不同程度的抑制作用。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高浓度K+对酶的抑制都表现为可逆非竞争性抑制类型，K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+和Ca2+对酶的抑制常数KI分别为1.27 mol/L、20.91、40.43、1.95和108.12 mmol/L。 在特定浓度范围内，果糖、乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖对睾丸NAGase活力有不同程度的抑制作用，果糖和乳糖的抑制作用较弱，葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖对酶的抑制作用强。葡萄糖对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型，它的抑制常数K1为153.37 mmol/L；N-乙酰-D-氨基葡萄糖对酶的抑制类型是可逆混合型抑制类型，抑制常数KI与KIS分别为5.17和12.52 mmol/L；蔗糖对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型，它的抑制常数KI为1.69mol/L。 研究常用的精液稀释液成份谷氨酸钠、柠檬酸钠、维生素C、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠对酶的作用，结果表明谷氨酸钠和磷酸二氢钠对山麻鸭睾丸NAGase有抑制作用；柠檬酸钠和磷酸氢二钠对酶活力的影响均是先激活后抑制；维生素C对酶有很强的激活作用。磷酸二氢钠和磷酸氢二钠对酶的抑制都属于可逆混合型抑制类型，抑制常数KI与KIS分别为36.55、210.7 mmol/L和94.65、273.06 mmol/L。 以非极性氨基酸：丙氨酸(L-Ala)、缬氨酸(L-Val)、苯丙氨酸(L-Phe)、蛋氨酸(L-Met)、脯氨酸(L-Pro)；极性氨基酸：甘氨酸(L-Gly)、苏氨酸(L-Thr)、丝氨酸(L-Ser)、谷氨酰胺(L-Gln)；碱性氨基酸：精氨酸(L-Arg)、组氨酸(L-His)和赖氨酸(L-Lys)作为效应物，测定氨基酸对山麻鸭睾丸NAGase活力的影响。L-Ala、L-Val、L-Phe、L-Met、L-Gly、L-Thr、L-Gln对酶活力有微弱的抑制作用；L-Ser对酶有微弱的激活作用；L-Pho、L-Arg、L-His、L-Lys对酶活力抑制作用较为明显。L-Pho和L-His对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型，抑制常数KI分别为1.62和256.75mmol/L，L-Arg和L-Lys对酶的抑制表现为可逆反竞争性抑制，抑制常数KI分别为8.42和15.98 mmol/L。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1糖链和糖链缀合物的研究概况

1.1.1糖链和糖链缀合物的简介

1.1.2糖链和糖链缀合物的研究

1.1.3生殖细胞中的糖链和糖蛋白

1.2糖苷水解酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究情况

1.2.1糖苷酶的简介及功能

1.2.2糖苷酶的研究概况

1.2.3 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究

1.3本课题的研究内容与研究意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验试剂

2.3仪器设备

2.4实验方法

2.4.1蛋白质浓度的测定

2.4.2酶活力的测定

2.4.3酶的分离纯化

2.4.4酶的性质测定

2.4.5酶催化反应的动力学性质的研究

2.4.6效应物对碱性NAGase活力的影响

3结果与分析

3.1酶的分离纯化与纯度鉴定

3.1.1睾丸NAGase的分离纯化与纯度鉴定

3.2酶的理化性质

3.2.1酶的分子量

3.2.2酶的亚基分子量

3.2.3酶的等电点

3.3酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的动力学性质

3.3.1温度对酶活力的影响和酶的热稳定性

3.3.2 pH对酶活力的影响和酶的酸碱稳定性

3.3.3酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的动力学参数测定

3.3.4酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的活化能测定

3.4金属离子对酶活力的影响

3.4.1 Na+、K+对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.4.2 Zn2+、Cu2+对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.4.3 Ca2+、Mg2+对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.5糖对酶活力的影响

3.5.1果糖对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.5.2乳糖对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.5.3葡萄糖对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.5.4 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.5.5蔗糖对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.6精液稀释液成份对酶活力的影响

3.6.1谷氨酸钠对山麻鸭睾丸NAGase的浓度效应

3.6.2柠檬酸钠对山麻鸭睾丸NAGase的浓度效应

3.6.3维生素C对山麻鸭睾丸NAGase的浓度效应

3.6.4 HPO42-和H2PO4-对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.7氨基酸对酶活力的影响

3.7.1 L-Pro对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.7.2 L-His对酶活力的影响

3.7.3 L-Arg对山麻鸭睾丸NAGase的影响

3.7.4L-Lys对山麻鸭睾丸NAGase的影响

4讨论

4.1酶的分离纯化与理化性质

4.2金属离子对山麻鸭睾丸NAGase活力的影响

4.3糖对山麻鸭睾丸NAGase活力的影响

4.4精液稀释液成分山麻鸭睾丸NAGase活力的影响

4.5氨基酸对山麻鸭睾丸NAGase活力的影响

结论

参考文献

致谢