pcDNA3.1（+）/hFasL真核表达载体的构建及在甲状腺相关性眼病动物模型中的治疗应用

摘要

目的：构建pcDNA3．1(+)／hFasL真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬时表达，为进一步研究hFasL的生物学功能及其应用奠定基础。 方法：经XbaI酶切原核质粒载体pBluescriptIIKS(+)／hFasL得到hFasLcDNA全长序列。回收、纯化琼脂糖凝胶后，将目的片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+)的多克隆位点。重组质粒pcDNA3．1(+)／hFasL首先经过酶切初步鉴定，再经DNA序列分析确认构建正确；阳离子脂质体法转化COS-7细胞并经免疫细胞化学染色检测重组体的表达。 结果：经单酶切pBluescriptIIKS(+)／hFasL可得到一条约0．97kb的片段，与预期的hFasLcDNA大小相符。重构质粒经限制性核酸内切酶XbaI、DraII及HindlII酶切鉴定，所得片段大小同预期相符；序列分析结果与GenBank中收录的hFasLcDNA全长序列一致，表明真核表达载体pcDNA3．1(+)／hFasL构建正确。以阳离子脂质体法转化COS-7细胞后，免疫细胞化学染色检测表明转化细胞能够表达hFasL。 结论：成功构建了重组表达质粒pcDNA3．1(+)／hFasL并能在真核细胞中进行表达。为进一步研究hFasL与凋亡相关疾病的关系及其应用奠定了一定的基础。 目的：(1)用人促甲状腺激素受体(hTSHR)的全长eDNA免疫BALB／c小鼠，再以其活化的脾细胞免疫同源BALB／c小鼠而获得类似人类甲状腺相关性眼病的动物模型。(2)探求真核表达载体pcDNA3．1(+)／hFasL在甲状腺相关性眼病动物模型中的治疗作用。 方法：(1)用hTSHR全长cDNA(pcDNA3．1(+)／hTSHR)分别于第O、3、6周经胫前肌注射免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠，第18周处死动物，机械分离脾细胞免疫同源BALB／c雌性小鼠而获得甲状腺相关性眼病的动物模型。(2)眼球后注射pcDNA3．1(+)／hFasL并于2周后检测其对动物模型TAO的作用(A3a组，接受pcDNA3．1(+)／hTSHR活化脾细胞免疫、并用pcDNA3．1(+)／hFasL治疗组)，同期设立模型组(A3b组，接受pcDNA3．1(+)／hTSHR活化脾细胞免疫、未予治疗)和对照组(B3组，以空质粒pcDNA3．1(+)进行活化脾细胞免疫和治疗)。实验结束后，分离眼眶组织行组织学检查；分离血清以测定TT4、TSH及TRAb。 结果：(1)组织学检查：A3a组19只小鼠中只有3只(约15．8％)出现了TAO的组织学改变，另外与A3b组相比，可见脂肪组织萎缩、水肿较轻、无明显炎性细胞浸润。电镜显示有凋亡细胞出现。A3b组19只小鼠中有10只(约52．6％)的眼眶组织出现水肿、脂肪组织增生、肌纤维局灶性透明变性、溶解断裂以及少量、散在炎性细胞浸润。电镜显示眼外肌肌原纤维排列紊乱、肌浆网扩张。B3组小鼠的眼眶组织没有明显的形态学改变。(2)血清指标检测：A3a组(TT424．76±14．37ng／mL，TSH1．32±0．33)与A3b组(TT460．77±31．86ng／mL，TSH1．05±0．35)相比，TT4显著降低、TSH显著升高(p<0．05)；并且A3a组和B3组(TT419．39±7．45，TSH1．36±0．30)之间TT4、TSH水平无统计学差异。血清TRAb在A3a、A3b、B3组之间均无统计学差异。 结论：(1)hTSHR活化的脾细胞免疫同源雌性BALB／c小鼠可以有效地建立类似人类TAO的动物模型。(2)眼球后注射pcDNA3．1(+)／hFasL治疗实验动物TAO取得了一定效果，提示依据Fas-FasL凋亡途径机制、应用表达hFasL的基因治疗有可能成为一个治疗TAO的新的、有意义的途径。

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符号说明

第一部分pcDNA3.1(+)/hFasL真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

第二部分pcDNA3.1(+)/hFasL在甲状腺相关性眼病动物模型中的治疗应用

全文结论

参考文献

文献综述 自身免疫性甲状腺疾病与细胞凋亡

致谢

攻读硕士学位期间发表和待发表的论文