Real-time PCR检测HCMV的方法学建立及初步应用

摘要

目的：采用TaqManMGB探针技术建立一种检测人巨细胞病毒(HCMV)感染的实时荧光定量PCR新方法。 方法：1．从GenBank中选择病毒复制所必需的在各株间具有高度保守性的HCMV即刻早期基因(IE基因)启动子的第四个外显子(HCMVMIEexon4)序列进行引物设计，同时考虑这段序列符合实时定量PCR引物及探针设计的要求。通过PCR扩增得到20lbp大小的DNA片段，并将其克隆入pMDl8-T载体(TA克隆)构建重组质粒作为实时定量PCR定量的标准品。2．以构建的重组质粒为模板，探讨实时定量PCR的最佳循环参数(反应条件)及反应体系，建立最优化的实时定量PCR方法，并对其进行方法学评价(包括重复性、特异性、线性范围等)。3．将构建的实时定量PCR法用于检测临床标本，并与ELISA法、普通PCR法及病毒分离法比较，以验证所构建方法的临床应用价值。 结果：1．经TA克隆成功地构建了重组质粒，经PCR鉴定与预期结果一致。核酸序列测定显示插入的HCMVMIEexon4扩增片段与GenBank报道的序列完全吻合。2．以重组质粒为模板，确定了实时定量PCR的最佳反应条件(循环参数)为：95℃5min；95℃20sec，60℃60see(40cycles)．20~tl最适反应体系为：镁离子浓度2．0mM、引物浓度0．SlxM、探针浓度1．5[tM、dNTP200~tM、10xbuffer2μl、TaqDNA聚合酶1．0U、DNA模板2．0~1。方法学评价结果：重复性较好(批内CV值为1．32‰批间CV值为1．96％)、特异性较好(HSV一1、HSV一2、弓形虫、HELF细胞无特异性扩增)、线性范围较宽(102_108copies／μ1)。 3．对临床标本进行检测，结果显示实时定量PCR法比ELISA法和普通PCR法有更高的阳性检出率，与病毒分离法结果基本一致。 结论：成功地建立了检测HCMV感染的实时荧光定量PCR新方法，为其临床应用奠定了基础。

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符号说明

摘要

前言

第一部分定量标准品的制备

第二部分实时定量PCR检测HCMV方法学的建立

第三部分实时定量PCR检测HCMV感染的初步应用

全文总结

参考文献

综述 定量PCR法检测人巨细胞病毒感染的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的文章及参加的学术会议