胚胎干细胞转录因子Foxd3转录调控机制及其成瘤性的初步研究

摘要

胚胎干细胞(embryonicstemcell，EScell)是来源于受精卵内细胞团(innercellmass，ICM)的多能细胞。具有无限自我更新的能力，而且能够分化生成机体各种细胞，由于这些特征，使其在再生医学中得到应用。ES细胞在体外长期培养而不发生分化，是其得到广泛应用的一个前提。目前研究发现有多种干细胞因子参与了ES细胞多能性的维持。其中包括Nanog和Foxd3。 Foxd3是Wingedhelix／forkhead转录因子家族中的一员，主要在ES和EC等多能细胞中表达。在早期胚胎发育过程中，Foxd3主要在胚泡阶段表达，E6．5天时在整个上胚层(epiblast)都有表达。它具有维持ES细胞多能性的能力。Xu等发现过表达Foxd3的32D髓系细胞能够抵抗G-CSF诱导的分化作用，从而维持其原始表型。Labosky等证明Foxd3对于小鼠胚胎细胞的维持是必不可少的。 Nanog是ES细胞中另一个多能因子，在ICM和EG、ES、EC等多能细胞中表达。它对ES细胞多能性的维持不依赖于LIF／Stat3通路。Nanog基因敲除小鼠的胚胎在发育过程中不能形成由多能细胞组成的上胚层。并且缺乏Nanog的ES细胞丧失了多能性，向胚外内胚层细胞分化。Nanog维持ES细胞多能性的机制尚不清楚，可能是通过激活多能性相关基因或是抑制抑制分化相关基因来行使多能性维持的功能。寻找Nanog靶基因是弄清Nanog多能性维持机制的关键。本室前期工作证明了Nanog作为转录因子，其C端结构域对其发挥转录激活作用相当重要。 综上所述，我们推测Nanog和Foxd3之间有着紧密的联系。原因有三：(1)Nanog和Foxd3都在多能细胞中特异表达；(2)都能维持ES细胞的多能性；(3)Nanog基因敲除小鼠和Foxd3基因敲除小鼠的胚胎表型相似。但Nanog基因敲除小鼠和Foxd3基因敲除小鼠的胚胎表型又不完全相同，Nanog基因敲除小鼠的胚胎没有上胚层，而Foxd3基因敲除小鼠的胚胎表现为上胚层减小。且二者在胚胎发育过程中出现时间的早晚略有差别，Nanog在桑葚胚晚期就能被检测到，而Foxd3是在胚泡阶段才开始被检测到。因此我们认为Foxd3可能是Nanog的下游靶基因。最近有两个实验室分别将配对端点双标记技术和基因组定位分析技术与染色体免疫沉淀技术结合，筛选出Foxd3可能是Nanog的靶基因。但是没有进一步证明。 现在越来越多的证据证明肿瘤是一种干细胞疾病，它由一个肿瘤干细胞增殖分化而来。肿瘤干细胞与干细胞非常相似，一些干细胞特异的标记基因在肿瘤干细胞中都有表达。最近研究发现精原细胞瘤和乳腺癌组织中有干细胞因子OCT4、NANOG、STELLAR和GDF3的表达，提示干细胞因子可能直接参与了肿瘤的形成或者是有价值的肿瘤标志物。Foxd3也是ES细胞因子，在决定正常或恶性ES细胞是增殖还是分化中发挥着重要作用。其机制可能是Foxd3抑制了细胞周期素依赖性激酶抑制剂p2l基因的表达，P21阻止细胞从G1期向S期转变。George等报道21例生殖细胞癌复发病人标本中有5例高表达Foxd3。那么Foxd3是否有成瘤作用呢?目前尚无报道。 本研究的主要目的是：(1)证明Foxd3是Nanog的下游靶基因，以期寻找Foxd3的转录调控机制；(2)探讨Foxd3是否具有促进细胞增殖和促进细胞恶性转化的作用。 本实验的第一章利用RT-PCR方法检测CGR8ES细胞、P19畸胎瘤细胞、F9畸胎瘤细胞和小鼠成纤维NIH3T3细胞中Nanog和Foxd3的表达。结果提示Nanog和Foxd3在各细胞间平行表达，表现为在F9和CGR8ES细胞中呈高表达，在P19细胞中表达较弱，在NIH3T3细胞中无表达。最后，我们动态观测维甲酸(RA)处理不同时间后，P19细胞中Nanog和Foxd3表达量的变化，发现Nanog和Foxd3都对RA的诱导敏感，在RA处理后Nanog和Foxd3表达迅速下降。而另一个多能因子Oct4对RA诱导不敏感，下降速度比二者慢。结果提示，在各种细胞间Nanog和Foxd3的表达模式相似，且在多能细胞分化过程中二者呈平行变化。 本研究的第二部分成功地构建了含Foxd3启动子的虫荧光素酶报告质粒Foxpl087-1uc，将其单独转染或与不同剂量Nanog表达质粒pCR3.1-NanogF共转染。虫荧光素酶实验发现Foxpl087-1uc在F9和P19细胞中有高的转录活性，而在NIH3T3细胞中较低，提示克隆的Foxd3启动子有可能介导Foxd3的细胞特异性表达。不同细胞中，外源性Nanog对Foxpl087-1uc的激活程度不一样。在NIH3T3细胞和人胚肾293T细胞中，Foxpl087-1uc被外源性Nanog呈剂量依赖性激活；在P19细胞中，低剂量的Nanog可以轻度激活Foxpl087-1uc，高剂量的Nanog反而不能对其激活；在F9细胞中，Nanog所用剂量均不能激活Foxpl087-1uc。为了证明内源性Nanog能维持Foxd3启动子的活性，本章采用RNAi的技术，减少F9细胞中内源性Nanog的表达，发现NanogRNAi表达质粒剂量依赖性抑制Foxpl087-1uc的活性。结果提示，Nanog能激活Foxd3启动子，且这种激活作用可能受负反馈的调节。 前面证明了Nanog可以激活Foxd3启动子转录活性，那么Nanog是否能够激活内源Foxd3的表达呢?本实验研究的第三部分成功地筛得NIH3T3-NanogF-Flag和NIH3T3-IRES2-EGFP稳定细胞株。应用RT-PCR技术分别检测NIH3T3-NanogF-Flag稳定细胞株和瞬时转染Nanog的P19细胞中Foxd3mRNA水平的改变；用Westernblotting方法检测了NIH3T3-NanogF-Flag稳定细胞株中Foxd3蛋白水平的改变。发现NIH3T3-NanogF-Flag细胞中Foxd3被重新激活，而对照组NIH3T3-IRES2-EGFP细胞中未检测到Foxd3的表达；瞬时转染Nanog的P19细胞中Foxd3的表达水平比对照组有所增加。提示Nanog能够激活内源性Foxd3的表达。 前面证明Foxd3的表达受Nanog的调控，那么介导Nanog转录激活Foxd3的顺式作用元件在哪里?本研究对Foxd3启动子序列进行分析，寻找Foxd3启动子上可能的Nanog结合位点(NanogbindingsiteinFoxd3promoter,NBF)，构建含有NBF的报告质粒p11NBFl、p5NBF2、p4NBF3，通过虫荧光素酶实验、定点突变技术和染色体免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)，寻找Foxd3启动子上的Nanog反应元件，结果发现在293T细胞、NIH3T3细胞和分化的CGR8ES细胞中p11NBFl能够被Nanog激活；将Foxd3启动子上一1026～lOl3和-994N-982两处的ATTA分别或同时突变成GCGC，结果发现双突变后的Foxd3启动子不能被外源Nanog激活；ChIP实验表明Nanog能在Foxd3启动子上募集。结果提示，Nanog可能通过直接与Foxd3启动子上的顺式作用元件相互作用发挥其对Foxd3的激活作用。 本研究第五章重点探讨NanogC端结构域是否与Nanog转录激活Foxd3有关。将报告质粒p11NBFl分别与野生型Nanog表达质粒pCR3．1-NanogF、Nanog缺失体表达载体N1(缺少WR和CD2两个转录激活子)和Nanog／VPl6嵌合体表达载体NHClVPl6(WR和CD2两个转录激活子被置换成VPl6)共转染，野生型Nanog能够激活报告质粒p11NBFl，N1不能激活，NHClVPl6对p11NBFl的激活存在细胞差异。将上述表达质粒瞬时转染NIH3T3细胞，RT-PCR检测Foxd3的mRNA水平，发现只有野生型Nanog能够重新激活NIH3T3表达Foxd3。以上结果提示NanogC端结构域对Foxd3的转录激活起到重要作用，缺失它以后Nanog的转录激活活性消失。 本研究最后一章探讨了Foxd3对细胞增殖和细胞成瘤性的影响。利用G418筛选的方法筛选NIH3T3-Foxd3-Flag和NIH3T3-3．1-Flag稳定细胞株；通过细胞计数绘制细胞曲线；利用流式细胞仪观察细胞周期变化；最后通过裸鼠移植瘤实验观察肿瘤生长情况，并用苏木素一伊红(HE)染色技术对肿瘤组织进行组织学分析。结果建立了NIH3T3-Foxd3-Flag和NIH3T3-3．1-Flag稳定细胞株，NIH3T3-Foxd3-Flag细胞的生长速度比NIH3T3-3．1-Flag对照细胞略有加快；S期细胞增加(P<0．05)，GO／G1期细胞减少(P<0．05)；注射NIH3T3-Foxd3-Flag的组的裸鼠全部长肿瘤(6／6)，而对照组未见肿瘤生成；组织学分析发现肿瘤细胞向横纹肌和脂肪组织浸润，核分裂相活跃，每高倍视野>5个核分裂相，肿瘤组织内血管丰富，为纤维肉瘤样改变。以上结果提示Foxd3能促进细胞增殖和恶性转化，促进肿瘤的发生。 综上所述，Nanog可以直接结合到Foxd3启动子，并激活Foxd3的转录。Nanog激活Foxd3转录的过程中Cdomain发挥了重要的转录激活作用。ES因子Foxd3能够促进细胞的增殖和恶性转化。

目录

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符号说明

摘要

前言

第一章多能性因子Nanog和Foxd3在胚胎干细胞及胚胎瘤细胞中共表达的研究

第二章Nanog对Foxd3启动子活性调节的研究

第三章Nanog对内源性Foxd3的激活作用

第四章Foxd3启动子上Nanog反应元件的鉴定

第五章C domain对Nanog转录激活Foxd3作用的影响

第六章Foxd3对细胞增殖及成瘤性的影响

照片

参考文献

文献综述胚胎干细胞多能性维持的分子机制

致谢

攻读学位期间发表文章