羟丙基-β-环糊精对分枝杆菌降解植物甾醇的影响

摘要

植物甾醇（phytosterol，PS）经生物转化可形成雄甾-4-烯-3，17-二酮（Androst-4-ene-3，17-dione，.D）和雄甾1，4-二烯-3，17-二酮（Androst-1，4-diene-3，17-dione，ADD），AD（D）是合成甾体药物的重要中间体。植物甾醇的低水溶性降低了反应体系中底物的利用率和反应速率，高浓度的底物/产物常导致生物催化剂的抑制或失活。羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）的特殊结构使其能作为主体包结疏水性甾体，提高甾体的溶解度，同时作为底物/产物储存库，降低底物/产物毒性。论文以分枝杆菌（Mycobacterium sp.）M2生物降解植物甾醇侧链生成AD（D）为反应模型，建立了HP-β-CD作用下的植物甾醇侧链降解生物转化工艺，初步探讨了HP-β-CD对植物甾醇生物转化的作用机理。
　　 以实验室保藏的分枝杆菌M1、M2和M3为出发菌株，经过含有CaCO3平板的透明圈法进行初筛和摇瓶复筛，得到了性能较佳的菌株M2-14，当植物子醇质量浓度为3g/L，转化168 h时植物甾醇转化率达到63.2％。
　　 分析考察了有机溶剂、表面活性剂和超分子等反应介质对分枝杆菌M2降解植物甾醇生成AD（D）的影响。结果表明加入HP-β-CD构建成一种新的超分子介质体系可以提高植物甾醇生物转化反应的反应速率和转化率，当植物甾醇质量浓度为5g/L，转化168 h时植物甾醇转化率达到89.8％，较对照实验提高了2.9倍。
　　 考察了HP-β-CD对菌种生长特性的影响，研究表明，分枝杆菌M2不能利用HP-β-CD；在液体培养基中HP-β-CD的添加不影响分枝杆菌M2的生长速率和生长量。经过高压液相色谱、红外光谱和核磁共振光谱分析，HP-β-CD的添加不影响植物甾醇的转化产物结构。
　　 建立了含有HP-β-CD的超分子体系的植物甾醇生物转化工艺。植物甾醇质量浓度为5g/L～10g/L，转化0h时添加与植物甾醇摩尔比为2:1的羟丙基-β-环糊精，转化72 h，植物甾醇转化率达到85.1‰～90.8％。
　　 确立了7 L发酵罐内植物甾醇生物转化的工艺条件。在植物甾醇质量浓度为5g/L时，植物甾醇转化率达到99％，其中ADD的生成率为80.5％，AD的生成率为3.4％。
　　 初步研究了HP-β-CD对植物甾醇生物转化的作用机理。添加与植物甾醇2倍摩尔比的HP-β-CD时，植物甾醇的溶解度由对照的0.66 mg/L增加到27.42 mg/L，增溶41倍；在植物甾醇生物转化反应中HP-β-CD包结AD（D），降低了产物的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 超分子的概述

1.2 环糊精的结构和性质

1.2.1 环糊精基本结构特征

1.2.2 环糊精的物理性质

1.2.3 环糊精的化学性质

1.2.4 环糊精的生物学性质

1.2.5 羟丙基-B-环糊精的特性

1.3 环糊精的包结作用

1.3.1 环糊精的包结作用结合机理及步骤

1.3.2 环糊精的包结物制备方法

1.3.3 包结作用的意义

1.4 甾体化合物的结构和功能

1.4.1 甾体化合物的结构

1.4.2 甾体化合物的种类、功能及发展状况

1.5 甾体化合物的微生物转化

1.5.1 甾体化合物的生物转化类型

1.5.2 甾体化合物微生物转化反应的特点

1.5.3 微生物转化甾体化合物的影响因素

1.6 环糊精在甾体生物转化中的研究进展

1.7 微生物甾体侧链降解

1.7.1 甾体激素生产原料的发展

1.7.2 微生物选择性降解甾体边链的机理

1.8 本课题的主要研究内容及意义

1.8.1 微生物法制备雄甾烯酮的作用和意义

1.8.2 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌种

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 主要实验仪器

2.1.4 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 添加HP-B-CD对PS和AD增溶效果比较

2.2.2 植物甾醇的侧链降解菌的菌种筛选

2.2.3 植物甾醇的侧链降解反应

2.2.4 植物甾醇转化产物的分析

2.2.5 生物量测定方法

2.2.6 HP-B-CD对分枝杆菌生长特性的影响

2.2.7 添加HP-B-CD后植物甾醇侧链降解产物的结构鉴定

3 结果与讨论

3.1 优良菌株的筛选

3.1.1 保藏菌株的植物甾醇侧链降解性能分析

3.1.2 菌株的分离与纯化

3.2 植物甾醇的侧链降解反应

3.2.1 反应介质对植物甾醇的侧链降解反应的影响

3.2.2 环糊精添加方式对植物甾醇生物降解反应的影响

3.2.3 环糊精添加量对植物甾醇生物转化的影响

3.3 HP-B-CD的添加对分枝杆菌生长特性的影响

3.4 加入HP-B-CD后转化产物的结构分析

3.4.1 高压液相色谱分析

3.4.2 红外光谱分析

3.4.3 核磁共振光谱分析

3.5 含有环糊精体系的PS生物转化反应

3.5.1 含有HP-B-CD体系的植物甾醇侧链降解反应

3.5.2 不同转化菌株对植物甾醇转化反应的影响

3.6 含有HP-B-CD体系的植物甾醇侧链降解反应的工艺条件优化

3.6.1 pH值对植物甾醇生物转化的影响

3.6.2 接种量对植物甾醇生物转化的影响

3.6.3 溶氧对植物甾醇转化的影响

3.77L发酵罐转化实验

3.7.1 操作参数的控制

3.7.2 分歧杆菌在7L发酵罐内的生物转化过程

3.7.3 转化产物的生成曲线

3.8 HP-B-CD提高植物甾醇生物转化的机理研究

3.8.1 HP-B-CD的增溶作用

3.8.2 HP-B-CD的加入降低了底物/产物抑制

4 结 论

5 展望

6 参考考献

7 攻读学位期间发表的论文

8 致 谢