腈水合酶产生菌的分离鉴定及其发酵条件研究

摘要

微生物催化法生产丙烯酰胺具有反应条件温和、选择性高、产品纯度高和收率高等优点。微生物菌种腈水合酶的合成能力是影响丙烯酰胺生产水平和经济效益的关键因素。本文从采集土样中分离到一株能利用丙烯腈生产丙烯酰胺的菌株，采用16S rRNA等现代分类技术并结合生理生化实验等经典分类技术对该菌株进行了分类鉴定。同时还研究了该菌株产酶条件和丙烯酰胺转化条件。
　　 通过对长期被腈化物污染的土壤中的微生物富集培养和筛选，得到一株具有腈水合酶活力为428U/mL的菌株ZH8，且该菌株表现出较强的底物耐受性。通过形态观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列分析和BIOLOG系统鉴定方法，该菌株鉴定为红球菌属（Rhodococcus）菌种，命名为Rhodococcus sp.ZH8。
　　 建立了Rhodococcus sp.ZH8的产酶条件，发酵培养基：葡萄糖15g/L、酵母粉5g/L、尿素7g/L、Co2+10 × 10-5mol/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、谷氨酸钠1g/L；培养条件：种龄25h、接种量6％、培养温度28℃、转速180r/min。菌体培养60h后酶活达到了855U/mL。
　　 Rhodococcus sp.ZH8的生长过程表明培养液pH，残余葡萄糖含量、细胞密度与酶活之间存在相关性。优化后产酶条件：培养液pH维持在7.0左右、菌体培养24h后添加的尿素为9g/L，培养周期为72h，发酵结束后酶活达到了4628U/mL。
　　 根据丙烯酰胺转化条件对丙烯酰胺生成率的影响，确定最佳的丙烯酰胺转化条件：28℃、pH 7.0的50mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液、20％的丙烯腈。底物浓度为20％时，丙烯酰胺生成率达100％。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 丙烯腈

1.1.1 丙烯腈的物化性质

1.1.2 丙烯腈的用途

1.2 丙烯酰胺

1.2.1 丙烯酰胺的物化性质

1.2.2 丙烯酰胺及其聚合物的用途

1.2.3 丙烯酰胺的生产方法

1.2.4 国内外微生物催化法生产AM的概况

1.2.5 我国微生物催化法生产AM的现状

1.3 腈水合酶

1.3.1 腈水合酶的结构特点

1.3.2 腈水合酶的反应机理

1.3.3 腈水合酶的合成调节

1.3.4 腈水合酶的光活性

1.3.5 腈水合酶的选择性

1.3.6 腈水合酶的热稳定性

1.3.7 腈水合酶活性的影响因素

1.4 本课题的研究意义及研究内容

1.4.1 本课题的立题依据及意义

1.4.2 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验样品及质粒

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 工具酶

2.1.6 主要溶液

2.2 实验方法

2.2.1 腈水合酶产生菌的分离筛选

2.2.2 菌落及细胞形态观察

2.2.3 生理生化实验

2.2.416S rRNA鉴定

2.2.5 BIOLOG系统鉴定

2.2.6 菌体培养及菌悬液的制备

2.2.7 腈水合酶活力及丙烯酰胺生成率的测定

2.2.8 腈水合酶产生菌产酶条件的建立

2.2.9 腈水合酶产生菌产酶条件的优化

2.2.10 丙烯酰胺转化条件的研究

2.2.11 生物量的测定

2.2.12 葡萄糖浓度的测定

2.2.13 丙烯酰胺浓度的测定

3 结果与讨论

3.1 腈水合酶产生菌的分离筛选

3.1.1 腈水合酶产生菌的分离

3.1.2 腈水合酶产生菌的筛选

3.1.3 腈水合酶活性中心辅助因子的分析

3.2 腈水合酶产生菌ZH8的分类与鉴定

3.2.1 菌落形态

3.2.2 细胞形态

3.2.3 生理生化特征

3.2.4 菌株ZH8的16S rRNA鉴定

3.2.5 Rhodococcus sp.ZH8的BIOLOG系统鉴定

3.3 Rhodococcus sp.ZH8的产酶条件的建立

3.3.1 种子生长曲线

3.3.2 种龄对腈水合酶活性的影响

3.3.3 接种量对腈水合酶活性的影响

3.3.4 培养温度对腈水合酶活性的影响

3.3.5 Co2+浓度对腈水合酶活性的影响

3.3.6 碳源对腈水合酶活性的影响

3.3.7 氮源对腈水合酶活性的影响

3.3.8 尿素对腈水合酶活性的影响

3.4 Rhodococcus sp.ZH8产酶条件的优化

3.4.1 Rhodococcus sp.ZH8的生长过程曲线

3.4.2 调控pH对腈水合酶活性的影响

3.4.3 尿素添加时间的选择

3.4.4 尿素浓度的影响

3.5 丙烯酰胺转化条件的研究

3.5.1 Rhodococcus sp.ZH8对丙烯酰胺的耐受性

3.5.2 反应温度对丙烯酰胺生成率的影响

3.5.3 反应介质pH对丙烯酰胺生成率的影响

3.5.4 丙烯腈对丙烯酰胺生成率的影响

4 结论

4.1 腈水合酶产生菌的分离、筛选

4.2 腈水合酶产生菌的鉴定

4.3 Rhodococcus sp.ZH8产酶条件的建立

4.4 Rhodococcus sp.ZH8产酶条件的优化

4.5 丙烯酰胺转化条件的研究

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢