矮牵牛PMADS9，PMADS1和CHSJ基因片段克隆及hpRNAi载体构建

摘要

RNA干扰(RNAi)是一种新发现的通过dsRNA介导的特异同源靶基因抑制途径。因RNAi基因沉默具有高效、特异和简捷等优点，为细胞内基因表达研究提供了新思路、新方法，从而使其具有广阔的应用前景。近年来RNAi引起的PTGS逐步被用于基因功能的研究，并且在植物的抗病毒及品质遗传改良中的应用也得到了长足的发展。 以往对植物基因进行转录后沉默的手段有反义识别和共抑制两种。但是，通过这两种手段仅能得到有限数目的沉默个体植株。2001年，S.Varsha Wesley等人通过对一种能过自我满足配对的发夹结构的RNA(hpRNA)的研究证实了此种结构可有效提高基因沉默效率。利用这种在正义臂及反义臂结构之间存在一个内含子结构的载体可更加有效的提高基因沉默的效率。从而比反义识别及共抑制在对基因功能的研究上更加有效。 MADS-box基因是指含有保守的DNA结合域MADS盒的转录调控因子，它们广泛存在于真核生物界。是一类重要调节基因，在植物发育(尤其是花器官发育以及同源异型转换中)过程中扮演者十分重要的角色。分离并研究MADS-box基因，将有助于探明植物生殖发育的分子模式，并为观赏植物和花卉品种的基因工程改良奠定基础。 PMADS9是最近在观赏花卉矮牵牛中发现的AGL15亚家族基因，其功能尚未报道。本实验通过PCR技术从矮牵牛幼蕾cDNA中克隆出PMADS9，PMADS1和CHSJ基因，分别构建了hpRNAi植物表达载体，并利用农杆菌介导法分别将三个基因导入矮牵牛。主要实验结果如下： 1.矮牵牛PMADS9基因片段的克隆与表达载体构建 以矮牵牛(Petunia hybrida)基因组DNA为模板，通过设计两对分别添加不同酶切位点的特异引物，利用PCR技术扩增获得PMADS9基因片段。PMADS9基因片段序列与已公布序列(GenBank登录号：AY370526)中相应片段完全一致，构建了hpRNi植物表达载体pDH-1。 2.矮牵牛PMADS1基因片段的克隆与表达载体构建 以矮牵牛(Petunia hybrida)幼蕾cDNA为模板，通过设计两对分别添加不同酶切位点的特异引物，利用PCR技术扩增获得PMADS1基因片段。序列分析表明，PMADS1基因片段序列与已公布序列(GenBank登录号：X14599)比对，所扩增片段与之完全一致。构建了hpRNAi植物表达载体pDH-2。 3.矮牵牛CHSJ基<片段的克隆与表达载体构建 以矮牵牛(Petunia hybrida)幼蕾cDNA为模板，通过设计两对分别添加不同酶切位点的特异引物，利用PCR技术扩增获得CHSJ基因片段。序列分析表明，CHSJ基因片段序列与已公布序列(GenBank登录号：X14599)比对，所扩增片段与之完全一致。构建了hpRNAi植物表达载体pDH-3。

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论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1 RNAi研究进展

1.1.1 RNAi发现

1.1.2 RNAi的作用机理

1.1.3 RNAi的生物功能

1.1.4 RNAi的应用

1.2植物MADS-box基因研究进展

1.2.1 MADS-box基因的概述

1.2.2植物MADS-box基因及其编码的蛋白转录因子的结构

1.2.3植物MADS-box基因的调节机理

1.2.4植物MADS-box基因与花器官的发育

1.2.5植物MADS-box基因的生物学功能及其多效性

1.3植物查尔酮合成酶研究进展

1.3.1查尔酮合成酶概述

1.3.2 CHS基因影响植物生理代谢方面的研究

第2章 引 言

第3章矮牵牛PMADS9基因的克隆及表达载体构建

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌种和质粒

3.1.3主要试剂

3.1.4主要设备

3.1.5常用溶液配方

3.2实验方法

3.2.1矮牵牛PMADS9基因片段的克隆

3.2.2 hpRNhi表达载体pDH-1的构建

3.3结果与分析

3.3.1矮牵牛PMADS9基因片段的克隆与序列分析

3.3.2 hpRNAi表达载体pDH-1的构建

第4章矮牵牛PMADS1基因的克隆及HPRNAi表达载体构建

4.1实验材料

4.1.1植物材料

4.1.2菌种和质粒

4.1.3主要试剂

4.1.4主要设备(同3.1.4)

4.1.5常用溶液配方(同3.1.5)

4.2实验方法

4.2.1矮牵牛PMADS1基因的克隆

4.2.2植物表达载体pDH-2的构建

4.3结果与分析

4.3.1矮牵牛PMADS1基因片段的克隆与序列分析

4.3.2 hpRNAi表达载体pDH-2的构建

第5章矮牵牛CHSJ基因的克隆及HPRNAi表达载体构建

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2菌种和质粒

5.1.3主要试剂

5.1.4主要设备(同3.1.4)

5.1.5常用溶液配方(同3.1.5)

5.2实验方法

5.2.1矮牵牛CHSJ基因的克隆

5.2.2植物表达载体pDH-3的构建

5.3结果与分析

5.3.1矮牵牛CHSJ基因片段的克隆与序列分析

5.3.2 hpRNAi表达载体pDH-3的构建

第6章PMADS9、PMADS1、CHSJ基因对矮牵牛的遗传转化

6.1实验材料

6.1.1植物材料

6.1.2菌种和质粒

6.1.3主要试剂

6.1.4主要设备(同3.1.4)

6.1.5基本培养基配方

6.2实验方法

6.2.1培养条件

6.2.2矮牵牛的遗传转化

6.2.3转基因植株的检测

6.3结果与分析

6.3.1矮牵牛的遗传转化

6.3.2 PCR检测

第7章 讨 论

7.1矮牵牛PMADS9基因、PMADS1基因和CHSJ基因片段的克隆

7.2表达载体构建

7.3矮牵牛的遗传转化

7.4转基因植株的鉴定

7.5后续研究

第8章 结 论

参考文献

致谢

附 录