基于转录组分析的PUB蛋白与甘蓝S-位点受体激酶的相互作用研究

摘要

自交不亲和（Self-incompatibility，SI）是显花植物防止自交、促进杂交，保持物种遗传多样性的重要机制之一。甘蓝等芸薹属（Brassica）植物属于典型孢子体型自交不亲和植物，其自交不亲和性由S位点（S-locus）上的复等位基因所控制。当自花授粉时，花粉落到柱头上，花粉中SCR可与柱头上SRK胞外域识别并特异性结合，引起SRK构象的变化和自体磷酸化，使其释放结合在SRK激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2（THL1/2），随后ARC1结合到SRK胞内激酶域上，并被磷酸化，ARC1是E3泛素连接酶，通过泛素化作用向下继续传导细胞信号，最终导致自交不亲和。最近研究表明，在琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）中通过反义抑制柱头内的ARC1基因表达，只能部分地打破材料的不亲和性；在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，ARC1直系同源基因是假性遗传因子，仅仅转入SRK-SCR基因后，拟南芥植株也能呈现出自交不亲和性。由此说明ARC1可能并非SRK唯一的下游信号蛋白，柱头内可能存在其他未知底物与SRK作用，在柱头内继续传递SI信号。在甘蓝自花授粉的过程中，柱头内PUB蛋白的活性急剧增高，由此我们推测柱头内可能存在其他的泛素蛋白与 SRK作用，因此前期对甘蓝高代自交不亲和A4的花期柱头做了自花授粉0 min和自花授粉30 min两种处理，提取了柱头总RNA后进行转录组测序分析，发现25条表达差异明显的PUB蛋白基因。我们挑取了4条表达差异最为明显的PUB蛋白进行后续研究，分别命名为 BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11；随后，运用qRT-PCR筛选出自花授粉后甘蓝柱头内基因表达水平发生变化的PUB蛋白。参照PUB蛋白基因的同源序列设计扩增引物，以甘蓝A4 cDNA为模板来扩增基因片段，构建T载体克隆并测序。为探究这些泛素蛋白能否 SRK发生相互作用，我们利用酵母双杂交技术和 GST pull-down技术检测PUB蛋白和SRK胞內域之间的相互作用。
　　本研究主要内容包括：⑴在转录组测序分析中，甘蓝柱头经过自花授粉0 min与自花授粉30 min两种处理，BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表达量上升，BoSU11的基因表达量下降。为更精确的探究自花授粉后甘蓝柱头中泛素蛋白的时空表达特异性，我们以未授粉、自花授粉15 min、30 min、60 min的柱头cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应，实验结果显示，自花授粉后，ARC1的表达量有所下降，同时BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的基因表达量相较于未授粉时也都在下降。我们注意到，BoSU11在荧光定量PCR中的基因表达量变化与在转录组测序分析中变化趋势一致，但是BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表达量在荧光定量PCR中是下降的，与转录组测序分析中对应时间点变化趋势不一致，这可能是因为转录组和荧光定量分析时获取自花授粉0 min柱头的时间点存在差异所导致。但是自花授粉后BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的基因差异表达进一步说明了BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11可能响应了自花授粉后柱头内的自交不亲和反应。⑵根据转录组测序所得的PUB基因片段序列，结合芸薹属基因数据库和甘蓝基因数据库，设计扩增基因引物。我们对BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的全长CDS序列进行生物信息学分析，发现其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；这4个PUB蛋白不含有跨膜结构域和核定位信号；在线分析这些泛素蛋白的理化性质和功能性位点，这4个PUB蛋白氨基酸序列都含有多个N-糖基化位点、cAMP或cGMP依赖性磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白Ⅱ磷酸化位点等功能性位点；BoSU07、BoSU11和ARC1一样不仅具有ARM臂重复结构，还含有U-box结构域；但是BoSU03、BoSU05仅含有ARM臂重复结构域，而不具备U-box结构域。⑶因为SRK的胞內域与ARC1的U-box结构域之间没有相互作用，而与其ARM臂重复结构域之间存在相互作用，故设计引物时摒除了泛素蛋白的U-box区段，并在引物上下两端分别加入限制性酶切位点，构建甘蓝泛素蛋白基因、ARC1和SRK的酵母表达载体：pGADT7-BoSU03、pGADT7-BoSU05、pGADT7-BoSU07、pGADT7-BoSU11、 pGADT7-ARC1、pGBKT7-SRK，通过毒性检测和自激活检测，发现构建的表达载体对酵母细胞没有毒性作用，也没有自激活作用；将PUB蛋白、ARC1的酵母表达载体分别和pGBKT7-SRK共转化酵母感受态AH109，观察共转化酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固体培养基上的生长状态，以此检测这些泛素蛋白与SRK之间的相互作用。实验结果显示，BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11、和ARC1与SRK的组合在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固体培养基上能够生长，且显现出蓝色反应，表明BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11可能与SRK发生相互作用。⑷依据共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理，通过研究 Promega蛋白纯化试剂盒原理来进行蛋白质间相互作用的检测。利用 pET43.1a作为表达载体表达BoSU07和BoSU11，利用pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11融合蛋白序列中的6×His标签与 Ni+结合，结合的复合物作为诱饵蛋白，把体外表达的pGEX-4T-1-SRK融合蛋白作为靶蛋白，pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11上结合的Ni+，孵育后利用其与磁力架吸附性将诱饵蛋白和靶蛋白的复合体纯化出来。SDS-PAGE试验结果显示，pET43.1a-BoSU07和pET43.1a-BoSU11融合蛋白都能够与pGEX-4T-1-SRK融合蛋白相互结合形成稳定的复合体，而与Ni+一起被洗脱下来，表明BoSU07、BoSU11都能与SRK胞內域发生相互作用。我们推测BoSU07、BoSU11作为PUB蛋白家族成员，很有可能通过与SRK相互作用，向下游传递自交不亲和信号，参与构成自花授粉后甘蓝柱头内的自交不亲和信号通路。筛选出新的与SRK相互作用的蛋白，对于进一步阐述SRK下游信号传导途径有重要的价值，同时为自交不亲和性的理论研究提供了新内容，为植物受体激酶作用机制的研究提供了新发现。

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第一章 文献综述

1.1 甘蓝孢子体型自交不亲和性的分子研究

1.2甘蓝自交不亲和性SRK下游信号底物的探究

1.3酵母双杂交系统

1.4 GST pull-down 技术

第二章 引言

2.1 研究的目的与意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

第三章 基于转录组分析和qRT-PCR的甘蓝柱头PUB蛋白基因的筛选

3.1 实验材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 甘蓝PUB蛋白基因的克隆和序列分析

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

第五章 酵母双杂交系统检验甘蓝PUB蛋白与SRK胞內域之间相互作用

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4讨论

第六章 BoSU07、BoSU11与SRK相互作用的GST pull-down技术体外检测

6.1 材料

6.2 方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

第七章 结论与展望

参考文献

致谢

附录

在校期间发表文章、参加项目及会议情况