类固醇受体辅激活因子SRC-3在小鼠电离辐射所致造血损伤中的调控保护作用及机制研究

摘要

造血组织对电离辐射极为敏感，是辐射损伤的主要靶器官之一。辐射射线可导致造血细胞大量凋亡或死亡，使细胞周期改变，细胞增殖迟缓，导致机体出现严重造血功能障碍。与此同时，电离辐射还可降低骨髓中基质细胞的数目和分泌细胞因子的能力，进一步阻碍辐射后造血机能的恢复。因此，尽量保护残存造血细胞的数量、促进照后造血细胞的增殖和维持照后造血微环境的稳定，是治疗辐射后造血损伤的有效措施。而如何同时在造血细胞和基质细胞中实现多途径、多靶点的辐射后保护，是治疗急性放射病造血损伤时新的思考。
　　类固醇受体辅激活因子-3(steroidreceptorcoactivator-3，SRC-3)是SRC家族中重要的一员，能够与多种核受体和转录因子相互作用，参与激活多条信号通路，完成相应靶基因的转录。SRC-3不仅能在机体中发挥了广泛的生物学功能;更作为促瘤因子参与促进多种肿瘤细胞的增殖和生长，以及对抗化疗药物引起的凋亡。已有报道证实，SRC-3在恶性血液细胞中高表达，并能发挥促增殖和对抗药物所致凋亡的作用。因此我们推断，SRC-3可能在外因所致的造血细胞损伤中发挥一定作用。目前，对SRC-3参与体内造血调控的机制尚不清楚，关于在辐射所致造血损伤中的作用更是未见报道。为了验证SRC-3是否参与了小鼠辐射后造血损伤效应，并探明其相关机制，我们以SRC-3基因敲除型和野生型小鼠为实验对象开展了以下实验。
　　我们通过海外合作的方式从美国休斯敦贝勒医学院引进SRC-3基因敲除小鼠的亲代小鼠，并在成功繁殖和进行基因表型鉴定后，获得一批理想的SRC-3基因敲除型和野生型实验用小鼠。在对所得实验小鼠按照不同基因型分组后，我们以60Coγ射线分别进行了6.0Gy和4.5Gy的全身照射(totalbodyirradiation，TBI)，制造了致死剂量照后和亚致死剂量照后两种不同的动物辐射损伤模型。
　　为了明确SRC-3在小鼠电离辐射所致造血损伤中的效应及探讨其相关机制，我们分别从体内、体外两方面展开实验。首先，我们评估了SRC-3-/-小鼠和野生型小鼠在辐射后不同的造血损伤效应，包括整体效应，如小鼠一般情况、死亡率、体重等指标;外周血细胞、骨髓造血组织、胸腺和脾脏淋巴组织的损伤情况;并检测了小鼠血清中造血相关细胞因子(IGF-1，IL-3，IL-6，TPO)的水平变化，验证了SRC-3在小鼠体内辐射后造血损伤和造血恢复过程中均能发挥防护作用。其次，我们以小鼠细胞作为实验对象，分两部分探讨了SRC-3参与调控和保护小鼠辐射后造血损伤的机制:1）以两种不同基因型小鼠的骨髓有核细胞(bonemarrownucleatedcells，BMNCs)作为研究对象，在辐射前和辐射后各时相点，检测了SRC-3对小鼠BMNCs细胞的凋亡、增殖、细胞周期、相关增殖通路的影响，以及对凋亡相关分子(NF-κB，p53，Bcl-2，Bax)和周期调控因子(cyclinA，E，D1，CDK2，CDK4，p21，p53)的调控作用，阐明了SRC-3在辐射后的小鼠BMNCs中的调控和保护作用。2）以两种不同基因型小鼠的骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)作为研究对象，在辐射前和辐射后各时相点，检测了SRC-3对小鼠BMSCs细胞的增殖活性、成纤维细胞集落形成单位(colony-formingunitoffibroblast，CFU-F)形成能力、增殖相关p-AKT蛋白表达量，和上清中VCAM-1，IGF-1，IL-3，IL-6和TPO水平的影响，明确了SRC-3在小鼠BMSCs细胞中的调控作用。所得结果总结如下:
　　主要结果:
　　1.以SRC-3+/-杂合子小鼠为亲代交配繁殖得到一定数目的野生型（SRC-3+/+）、杂合子（SRC-3+/-）和基因敲除的纯合子(SRC-3-/-)小鼠。通过PCR和Westernblot方法分别对子代小鼠进行基因表型和蛋白表型的鉴定后，将所得SRC-3-/-小鼠SRC-3+/+小鼠分组供实验用。蛋白表型鉴定结果发现SRC-3-/-小鼠中SRC-3基因已经彻底敲除，其骨髓、脾脏和胸腺组织中未测得SRC-3蛋白的表达;而野生型小鼠中骨髓细胞的SRC-3蛋白的表达水平显著高于其在脾脏和胸腺中的表达水平(P＜0.05)。
　　2.SRC-3-/-小鼠与同龄野生型小鼠比较，具有体重轻、身材短小、发育迟缓，成年雌鼠性成熟障碍，不易受孕等特点。正常情况下，与野生型比较，SRC-3-/-小鼠体重和血清中IGF-1水平显著偏低，两者比较存在统计学差异(P＜0.05)。并且发现，SRC-3-/-小鼠的外周血中WBC、RBC和PLT计数和骨髓有核细胞计数均略低于野生型;胸腺指数、脾脏指数略高于野生型，但两者比较无统计学差异。
　　3.给予致死剂量TBI后，SRC-3-/-小鼠显现出更严重的整体损伤效应，表现为一般情况更差、体重下降明显，30天生存率更低，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)，提示SRC-3-/-小鼠机体抗辐射能力更弱。
　　4.给予亚致死剂量TBI后，SRC-3-/-小鼠中外周血血象更低，骨髓有核细胞计数和造血集落形成单位计数更少，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)。同时骨髓病理切片提示所见辐射后SRC-3-/-小鼠的骨髓更空旷。提示SRC-3-/-小鼠辐射后显现出更加严重的外周血和骨髓的造血损伤效应。值得一提的是，SRC-3-/-小鼠的巨核系造血细胞在辐射后损伤尤重，在照射后11天极低点至随后恢复过程中的各时相点，均可观察到SRC-3-/-小鼠的外周血PLT计数、病理切片中骨髓腔巨核细胞数目和体外培养巨核系集落形成单位显著低于野生型，两者比较存在统计学差异(P＜0.05)。
　　5.给予亚致死剂量TBI后，在各个时相点可观察到，SRC-3-/-小鼠的脾脏指数和胸腺指数均略高于野生型，并与野生型比较无统计学差异。说明SRC-3-/-小鼠脾脏和胸腺的辐射后损伤程度明显低于骨髓损伤程度，因此SRC-3-/-小鼠的淋巴组织在辐射后的损伤效应与骨髓组织有所不同。
　　6.给予亚致死剂量TBI后，SRC-3-/-小鼠血清中IGF-1水平在照后各时相点持续处于较低水平，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)。SRC-3-/-小鼠血清中造血因子IL-3和IL-6在照后第7天显著均低于野生型，两者比较存在统计学差异(P＜0.05)。血清中细胞因子TPO水平则未发现存在组间差异。
　　7.用流式法测定两组小鼠的BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+细胞比例后发现，在正常情况下，两种小鼠BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+细胞比例无统计学差异。而辐射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs中凋亡率显著升高和Sca-1+细胞比例显著降低，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)。同时，用Westernblot方法测得辐射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中的凋亡蛋白p53和Bax表达显著升高，抗凋亡蛋白NF-κB(p65)和Bcl-2表达显著降低，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)。提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在辐射后凋亡增多、残留数目较少;其增高的凋亡敏感性与凋亡相关蛋白的表达量异常有关。
　　8.用流式法测定两组小鼠的BMNCs的细胞周期和增殖指数后发现，在正常情况下，两种小鼠BMNCs的细胞周期分布和增殖指数无统计学差异。而辐射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs表现出G0/G1期显著升高，S期阻滞的特点，同时增殖指数也显著低于野生型(P＜0.05)。进一步研究发现，辐射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中正性周期调控因子，包括CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4的表达水平显著降低;负性周期调控因子p53和p21的蛋白表达量显著升高，与野生型比较有统计学差异(P＜0.05)。并且，SRC-3-/-小鼠BMNCs中p-AKT蛋白表达量在辐射后下降，表明SRC-3-/-小鼠AKT增殖信号通路在辐射后活性降低。以上结果提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在辐射后存在细胞周期分布异常和增殖障碍的特点，其中周期调控因子的表达水平和的AKT信号通路活性辐射后降低，是导致辐射后造血恢复缓慢的重要原因。
　　9.用CKK-8法测定体外培养所得小鼠BMSCs的增殖活性后发现，正常情况下，SRC-3-/-小鼠的增殖活性显著低于野生型(P＜0.05);而辐射后两者组间差异更加显著(P＜0.01)。并且，SRC-3-/-小鼠的CFU-F形成能力在照前和照后均显著低于野生型，两者比较有统计学差异(P＜0.05)。另外，我们还检测了小鼠BMSCs中调控增殖的AKT信号通路活性，发现照前两组小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表达量水平接近;但在照后SRC-3-/-小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表达量显著低于野生型，两组比较有统计学差异(P＜0.05)。以上结果说明SRC-3-/-小鼠BMSCs的增殖能力和CFU-F形成能力在照射前降低，辐射后程度加重;而照射后SRC-3-/-小鼠BMSCs中AKT增殖信号通路活性降低可能是导致该损害加重的一个重要原因。
　　10.用ELISA法测定小鼠BMSCs细胞培养上清液中的细胞因子水平后发现，正常情况下，SRC-3-/-小鼠BMSCs上清中VCAM-1和IGF-1水平偏低，与野生型比较存在统计学差异(P＜0.05)。而辐射损伤后，SRC-3-/-小鼠BMSCs上清中VCAM-1、IGF-1、IL-3和IL-6水平均显著低于野生型，两者比较具有统计学差异(P＜0.05)，说明SRC-3-/-小鼠BMSCs分泌细胞因子的能力显著低于野生型。
　　结论:
　　1.缺乏SRC-3可增加致死剂量TBI后小鼠死亡率，表明SRC-3可以影响辐射后小鼠的存活率，在整体水平上提高小鼠对辐射损伤的防护能力。
　　2.缺乏SRC-3可导致亚致死剂量TBI后，小鼠骨髓损伤更重、造血恢复更缓慢。因此，SRC-3能减轻小鼠辐射后骨髓造血损伤程度，促进造血恢复，特别是对巨核系造血影响更加明显。
　　3.SRC-3与维持血清中IGF-1、IL-3和IL-6水平有密切关系。缺乏SRC-3可导致照射前后血清中的细胞因子IGF-1显著降低，以及照射后血清中IL-3和IL-6水平严重不足。
　　4.SRC-3可保护辐射后小鼠BMNCs中存活的Sca-1+细胞和降低凋亡细胞，并通过激活NF-κB(p65)蛋白和抑制p53蛋白辐射后的活性，降低小鼠BMNCs辐射后凋亡敏感性。
　　5.SRC-3可促进辐射后小鼠BMNCs的增殖和周期进程，降低G0/G1期比例，减少S期阻滞。其机制与上调正性周期调控因子CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4和下调负性周期调控因子p21和p53的表达水平，激活AKT信号通路有关。
　　6.缺乏SRC-3可导致正常情况下小鼠BMSCs的增殖活性、CFU-F形成能力，以及BMSCs上清中VCAM-1和IGF-1的水平显著下降。不仅如此，还可降低辐射后小鼠BMSCs中的p-AKT蛋白表达和上清中IL-3和IL-6的水平。因此SRC-3促进基质细胞的增殖和分泌细胞因子的能力;通过调控造辐射后基质细胞的数目和细胞因子的水平，维护造血微环境的稳定来实现对辐射后造血的防护。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 SRC-3基因敲除小鼠的鉴定和繁殖

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 SRC-3基因敲除小鼠辐射后的造血损伤效应

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 SRC-3对辐射损伤的调控保护机制研究

4．1 SRC-3在辐射前后对小鼠骨髓造血细胞的影响及其机制研究

4．2 SRC-3在辐射前后对小鼠骨髓基质细胞的影响及其机制研究

全文总结

参考文献

综述 类固醇受体辅激活因子3(SRC-3)的促瘤作用研究

博士研究生期间发表的文章

致谢