慢性束缚应激大鼠脑区BDNF的变化及逍遥散对其调节作用

摘要

应激是指机体受到各种应激原的刺激时，出现的以交感神经兴奋和下丘脑一垂体一肾上腺皮质(HPA)分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，以及由此引起的各种功能和代谢的改变。随着社会的高度发展，工作和生活节奏不断加快，时代对人类的要求也愈来愈高，人类将更多地处于应激之中，应激对人类的危害也将不断加剧。其中，慢性应激时，机体内稳态失衡，一系列的神经生化改变可导致大脑器质性损害，而与情绪，记忆密切相关的边缘系统尤其是海马结构则最易受到损害。杏仁核是应激性行为反应以及自主神经和神经内分泌反应的执行部位。已有很多研究结果证实杏仁核在应激行为反应中起重要作用。 目的：本课题主要选择大脑中相互联系和相互影响的两个区域——海马与杏仁体。从现代应激理论入手，结合中医学有关应激理论的研究成果，通过探讨慢性束缚应激时BDNF分布与表达，大脑突触可塑性的观察，以及逍遥散对BDNF调节作用，进一步探索慢性应激造成人体损伤及疾病的内在机制，以及肝主疏泄在应激中的主导地位及逍遥散在消除或减轻慢性应激时所产生的部分作用机理，这不仅有利于中医基础理论和临床的研究发展，而且对于许多应激性疾病的预防和治疗具有重要的意义。 方法： 1.理论研究主要探讨了以下几个方面的内容：①证候的基本概念及其研究意义；②证与症、病、病机、证素关系；③证候理论存在的不足之处；④应激反应与中医证候关系；⑤证的动物模型；⑥肝郁证证候的特点；⑦逍遥散的遣方制药及证候特点。 2.实验研究 将雄性SD大鼠72只，随机分为7天正常对照组(A组，n=6)、21天正常对照组(B组，n=6)、7天模型组(C组，n=6)、21天模型组(D组，n=6)、7天逍遥散组(E组，n=6)、21天逍遥散组(F组，n=6)6组，每组各6只。动物每笼6只群养，饲养于普通级动物房，室内温度保持为22±2℃，相对湿度保持为30～40％，各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。实验所用的中药复方分别选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散(北柴胡30g、当归30g、白芍30g、白术30g、茯苓30g、炙甘草15g、生姜10g、薄荷10g)，中药饮片均购自北京同仁堂药店，由中日友好医院制剂室严格将以上药物按一定的工艺制成药粉备用，用时根据需要用蒸馏水配制成一定的浓度。以慢性束缚方法制作应激大鼠模型，将大鼠束缚于特制的束缚架上，每日3小时，连续21天(A，C，E组为7天)。自造模第一日始，各用药组(E和F)每日在束缚前1小时分别灌服逍遥散5.82g/kg，灌胃容积为10ml/kg，其它各组则灌服等体积的蒸馏水。一周后，A、C、E组取材，其余3周后取材。再结合现代实验手段(免疫组化、Western blot、RT—PCR等)，从基因、蛋白水平，定位与定量相结合，检测BDNF表达水平，分析慢性应激对突触可塑性影响的内在机理，以及逍遥散作用的途径。 2．1免疫组织化学结果显示：在海马各区7天模型组BDNF的表达与正常组比较均下降，在CA1、CA3区(p<0.05)，在DG区无统计学意义。21天模型组与正常组比较也下降，在CA1、CA3区(p<0.01)，在DG区无统计学意义。治疗组BDNF的表达比模型组上升(p<0.01，p<0.05)；在杏仁核与7天正常对照组比较，7天模型组大鼠BDNF免疫反应积分光密度有下降趋势，但无统计学意义。与7天模型组和7天正常对照组比较，7天治疗组积分光密度下降(p<0.05)；与21天正常对照组比较，21天模型组大鼠BDNF免疫反应积分光密度降低，但无统计学意义，与21天模型组比较，21天治疗组积分光密度有下降趋势，但无统计学意义。与21天正常对照组比较，21天治疗组积分光密度显著下降(p<0.05)。 2.2Western blot结果显示7模型组与正常组比较在海马各区都有下降趋势，在DG区有显著性差异(P<0.01)，21天模型组与正常组比较在海马各区比7天模型组下降趋势明显(CAl<0.05，DG<0.01)，CA3无统计学意义。在使用逍遥散后7天，21天模型组的BDNF的表达都呈上升趋势；在杏仁核，模型组BDNF的含量不仅没有减少，还呈增加趋势，在使用逍遥散后其含量反而减少，可能与杏仁核的功能有关。 2.3RT-PCR结果显示在CA1、CA3、DG区7天模型组BDNF mRNA表达水平与7天正常组比较有下调趋势，但均无统计学意义，7天治疗组较7天模型组则有上调趋势，但只有在CA1区有显著差异性(P<0.01)。21天模型组与21天正常组比较则显著下调(P<0.01，P<0.05)，21天治疗组较21天模型组则显著上调(P<0.01，P<0.05)，但在DG区无差异性；在杏仁核，BDNF的表达情况和海马各区不同，它们几乎都在慢性应激后升高，7天模型组BDNFmRNA表达水平与7天正常组比较有上调趋势，但无统计学意义。21天模型组与21天正常组比较则显著上调，但无统计学意义，7天模型组较7天治疗组则显著升高(P<0.05)，21天治疗组较21天模型组则极显著下调(P<0.01)。 结论：慢性束缚应激影响了BDNF在海马和杏仁核中的表达，模型组在海马其含量总体呈下降趋势，在使用逍遥散后BDNF的含量上升，而在杏仁核区，却出现了完全不同的情况，在慢性束缚应激条件下，BDNF的表达呈上升趋势，海马和杏仁核往往结果相反，可能它们由不同的机制控制所引起。这也说明应激后BDNF对神经系统的保护作用减弱，应激的时间的越长，这种保护作用变得越弱，应激时间不同，BDNF的变化情况也有所不同，同时也提示应激时失去BDNF的保护可能是中枢神经系统受损的重要机理之一。使用逍遥散调节后，又向原来的方向变化，推测可能是与维持机体的平衡有关。说明逍遥散对海马和杏仁核有明显的调节作用。但逍遥散的调节作用不是一致性的。充分说明逍遥散的调节作用有时间性和区域性，与以前的实验结论一致。也说明逍遥散能影响BDNF蛋白有关的神经系统的突触可塑性的功能，以起到抗应激的作用。

目录

论文说明：英文缩略词

ABSTRACT

综述一神经营养因子与神经系统的突触可塑性

综述二慢性应激及其对海马和杏仁核的影响

理论研究

前言

1证候的基本概念及其研究意义

2证与症、病、病机、证素关系

3证候理论存在的不足之处

4应激反应与中医证候关系

5证的动物模型

6肝郁证证候的特点

7逍遥散的遣方制药及证候特点

参考文献

实验研究

前言

实验一慢性束缚应激脑区BDNF变化及逍遥散对其影响的免疫组织化学研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

实验二慢性束缚应激脑区BDNF变化及逍遥散对其影响的Western Blot分析

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

实验三慢性束缚应激脑区BDNFmRNA基因表达的变化及逍遥散对其调节作用

1材料与方法

2.结果

3讨论

参考文献

致谢

个人简历

附图