果糖基转移酶的固定化及低聚果糖的生产工艺研究

摘要

本文主要研究了固定化果糖基转移酶生产低聚果糖，包括游离果糖基转移酶的制备、固定化载体的选择固定化条件的优化、固定化酶的反应特性以及低聚果糖的生产、真空干燥制备低聚果糖粉等几个方面。果糖基转移酶属于胞内酶，用VCX400型超声波仪处理黑曲霉细胞提取果糖基转移酶，提取率约60％.从海藻酸钠、琼脂壳聚糖等几种载体中选择海藻酸钠作为果糖基转移酶的固定化载体，通过先吸附后交联的方法固定果糖基转移酶，在使用的两种交联剂中，戊二醛的固定化效果比较强，因此被选做为本实验的交联剂。固定化条件优化为:即加酶量400U/g，吸附pH5.5，吸附时间10h，吸附温度25℃，交联剂戊二醛用量0.75％，交联时间8h，交联温度4℃，最高酶活回收率为30.2％。固定化果糖基转移酶最适温度50℃，与游离果糖基转移酶相同;最适pH5.5，比游离酶提高了0.5个单位;其热稳定性和pH稳定性较游离果糖基转移酶均有一定的提高;动力学常数Km为0.52 mol/L（蔗糖），较游离果糖基转移酶（0.29 mol/L）增加约一倍，这说明该固定化酶对底物的扩散有一定的阻碍作用，酶与底物的亲和力减弱.在50℃、pH5.5的操作条件下，50％的底物蔗糖于流速0.48 mL/min时反应所生成的低聚果糖含量最高，为50.34％。此时，产物低聚果糖最高定容产率为222.91g/L。普通酶法或固定化方法生产低聚果糖得到的产物含量不高(50％)的原因主要在于反应的同时生成的副产物葡萄糖对果糖基转移酶有强烈的抑制作用。另外，也由于黑曲霉中的果糖转化酶使得产物低聚果糖的含量降低。固定化酶装柱生产低聚果糖，50℃下连续操作生产13天（每天8h以上），其酶活力保持在87％以上，使用到23天时活力下降到50％，即半衰期为23天。在此生产期间（一个月左右）内未发现染菌现象，其固定化强度也保持不变。主要原因可能是采用的底物浓度(50～60％)和操作温度(50℃)较高，抑制了细菌的生长。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 功能性低聚糖的概述

1．1．1 功能性低聚糖的发展背景

1．1．2 功能性低聚糖的应用价值

1．1．3 功能性低聚糖的应用开发进展

1．1．4 功能性低聚糖的发展状况

1．2 低聚果糖概述

1．2．1 低聚果糖定义及化学结构

1．2．2 低聚果糖安全性

1．2．3 低聚果糖的理化性质

1．2．4 低聚果糖的生理功能

1．2．5 低聚果糖的生产原理

1．2．6 低聚果糖的生产方法介绍

1．2．7 常见的工业化生产方法的比较

1．3 本课题的立题意义与研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要原材料

2．1．2 主要试剂及来源

2．1．3 主要仪器及设备

2．1．4 主要培养基

2．2 实验方法

2．2．1 黑曲霉斜面培养

2．2．2 黑曲霉种子培养

2．2．3 黑曲霉摇床发酵培养

2．2．4 菌体的制备

2．2．5 产酶反应

2．2．6 酶活测定方法

2．2．7 发酵产酶条件的确定

2．2．8 酶反应合成低聚果糖产量最佳工艺

2．2．9 固定化方法的选择

2．2．10 固定化条件的优化

2．3 固定化果糖基转移酶及FOS生产工艺条件的研究

2．3．1 30L发酵罐生产FOS的研究

2．3．2 菌丝的提取

2．3．3 固定化酶的制备

2．3．4 固定化工艺的确定

2．3．5 工业化生产FOS的最佳工艺确定

2．3．6 真空冷冻干燥

2．4 FOS检测方法

2．4．1 HPLC检测

2．4．2 化学法检测

3 结果与讨论

3．1 发酵产酶条件的确定

3．1．1 碳源的影响

3．1．2 氮源的影响

3．1．3 最佳初始pH确定

3．1．4 培养温度对低聚果糖合成的影响

3．1．5 最佳培养时间的确定

3．1．6 最佳接种量的确定

3．1．7 正交试验

3．2 果糖基转移酶反应特性研究

3．2．1 最适pH值的确定和pH稳定性

3．2．2 反应温度的确定

3．2．3 反应时间的确定

3．2．4 初始蔗糖浓度对酶反应的影响

3．2．5 果糖基转移酶的动力学常数

3．2．6 正交试验

3．3 固定化方法的选择

3．3．1 包埋材料的选择

3．3．2 以海藻酸钠为材料的固定方式的确定

3．3．3 戊二醛为交联剂时固定化条件的选择

3．3．4 加酶量的选择

3．3．5 吸附pH的选择

3．3．6 吸附时间的选择

3．3．7 吸附温度的选择

3．3．8 戊二醛用量对酶固定化效果的影响

3．3．9 交联时间的选择

3．3．10 交联温度的选择

3．3．11 氯化钙浓度对酶固定率的影响

3．3．12 海藻酸钠浓度对颗粒强度和FOS产率的影响

3．3．13 正交试验

3．3．14 固定化酶生产工艺流程的最终确定

3．4 固定化果糖基转移酶反应条件的优化

3．4．1 含酶量不同的固定化酶在不同时间的FOS产率

3．4．2 温度对FOS产率的影响

3．4．3 底物浓度对FOS产率的影响

3．4．4 pH对FOS产率的影响

3．4．5 游离酶和固定化酶的热稳定性比较

3．4．6 酶的动力学常数

3．4．7 反应进程曲线的比较

3．5 固定化酶连续制备低聚果糖的研究

3．5．1 固定化酶分批式制备低聚果糖

3．5．2 固定化酶连续制备低聚果糖

3．6 固定化酶使用寿命

3．6．1 固定化酶操作稳定性

3．6．2 固定化过程影响FOS产率的分析

3．7 真空冷冻干燥法制备低聚果糖

3．7．1 共晶点和共融点测定结果

3．7．2 样品厚度对干燥效果的影响

3．7．3 预冷冻速率对干燥效果的影响

3．7．4 加热温度对干燥效果的影响

3．7．5 真空度对干燥效果的影响

3．7．6 冷阱温度对干燥效果的影响

4 结论

4．1 发酵产酶最佳条件的确定

4．2 游离果糖基转移酶反应特性确定

4．3 固定化方法的选择

4．4 最佳固定化条件的确定

4．5 固定化果糖基转移酶反应条件的优化

4．6 固定化酶连续制备低聚果糖的研究

4．7 固定化酶使用寿命的确定

4．8 真空冷冻干燥制备低聚果糖工艺的研究

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢