Dok5在神经系统中的功能研究——Dok5参与Neurotrophin信号转导的研究

摘要

Neurotrophins在神经细胞的增殖、分化、存活、迁移、凋亡、突触的可塑性，维持神经元的正常生理功能以及学习和记忆等高级功能中具有非常重要的作用。Trk(_tropomyosin-relatedkinase，原肌球蛋白相关激酶)受体是neurotrophins的高亲合力受体，是细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，该家族包括在结构上高度同源的3个成员：TrkA、TrkB和TrkC。在neurotrophins刺激下，Trk受体迅速二聚体化并激活其自身的酪氨酸激酶活性，活化的受体能够募集多种信号蛋白并将它们磷酸化，从而将信号由胞外转导到胞内。 Dok(downstreamoftyrosinekinase/Dockingprotein)家族蛋白是胞浆接头蛋白，参与多个信号通路的转导。该家族蛋白具有信号蛋白典型的结构特征：N端的PH结构域、中央的PTB结构域以及C端区域。目前发现的该家族成员有6个：Dok1、Dok2、Dok3、Dok4、Dok5和Dok6。其中，Dok1、Dok2和Dok3主要在血液系统中表达，Dok4在多种组织中表达，Dok5主要在神经系统和肌肉中表达，Dok6主要在神经系统中表达。Dok家族蛋白可作为酪氨酸激酶的底物，参与调控多个信号通路。很多酪氨酸激酶，包括非受体酪氨酸激酶(如Src家族激酶)，以及受体酪氨酸激酶(如胰岛素受体，B细胞受体，c-Ret受体等)都可以磷酸化Dok蛋白，从而调节下游信号。 人Dok5全长cDNA由本室(胡松年、谈昕煜)于1998年从人胎脑cDNA文库中分离克隆，并提交Genebank，其接收号为NM018431。本室先前的表达谱分析(唐开福、康立山等)表明Dok5主要在神经系统和肌肉组织中表达。结合本室早期的工作基础，我们继续进行了Dok5在神经系统中的功能研究。结合生物信息学的分析和相关文献线索，我们预测Dok5可能参与神经系统特异表达的Trk家族受体介导的信号转导。为了证明这个设想，我们首先应用了酵母双杂交实验来检测Trk家族受体和Dok5间是否具有相互作用，结果证明在酵母双杂交系统中Dok5与TrkB、TrkC胞内区有强相互作用，而与TrkA的相互作用很弱。通过结构域分段验证实验，我们证明Dok5通过其PTB结构域结合TrkB、TrkC受体。随后我们在Pulldown实验和Co-IP实验中验证了它们的相互作用。通过氨基酸突变分析我们进一步确定了Dok5结合TrkB、TrkC受体的NPQY模体，这种结合依赖酪氨酸的磷酸化。在激光共聚焦实验中，Dok5和TrkB、TrkC受体在正常和分化的PC12细胞中共定位。通过竞争实验，我们证明Dok5可以和N-Shc竞争结合TrkB、TrkC受体。为了确定Dok5在neurotropin信号通路中的作用，我们检测了Dok5对MAPK信号通路的影响，结果显示Dok5可以增强TrkB、TrkC受体介导的MAPK通路的活化水平并延长其活化时间。 综上，我们证明了Dok5以依赖于磷酸化的方式结合TrkB、TrkC受体，并参与TrkB、TrkC受体介导的MAPK信号通路的活化。这为进一步揭示Dok5在神经系统发育分化中的作用提供了重要的线索，为进一步研究其生理功能奠定了基础。

目录

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小 结

参考文献

综述:Neurotrophin及Trk受体介导的信号转导及其在神经系统中的功能

附录:英汉名词对照

发表文章及会议摘要

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