PCR-DGGE分析高温制曲中细菌群落变化的研究

摘要

大曲是指含有大量能发酵的活微生物或酶类的糖化发酵剂。制曲技术是我国特有的一份民族遗产。曲是各种白酒香型风味的重要成因，不同曲中的微生物种类不同，相应白酒的香型也会不同。
　　 本论文以高温大曲为研究对象，采用以PCR-DGGE为主的分子生物学方法，初步分析了制曲过程中各主要阶段的细菌菌群的变化，为强化大曲发酵剂的开发提供了理论依据。
　　 本论文实验内容主要分为四部分：第一，在提取大曲细菌总DNA过程中，比较了五种基于不同裂解原理的DNA提取方法的效果，发现SDS-酶法结合使用的提取方法，高温大曲中细菌总DNA的提取效率最高，且产量和质量最好，从而为后期实验提供良好的DNA模板。第二，由于实验中采用的引物存在特殊的“GC夹板”结构，本论文对目的基因的PCR扩增方法进行了优化，比较了不同PCR方法的扩增结果，结果显示，采用巢式PCR对16S rDNA V3区进行扩增，不但提高了对目的产物扩增的特异性，同时也使产量得以提高。第三，在预实验中，首先通过垂直胶电泳对DGGE变性浓度梯度范围进行了确定，然后采用时间间隔法选择了最佳电泳时间。结果显示，变性梯度在30％-55％的范围内样品的分离效果最佳，同时确定电泳时间为10h。第四，通过PCR-DGGE技术对制曲过程中细菌的变化进行初步研究，结果表明：在制曲前期优势细菌群落变化较为突出，菌群结构更替频繁，主要优势条带的相似菌有：Bacillus sp。SSCS14-2，Bacillus galactosidilyticus，Virgibacillus carmonensis，Thermoactinomycessanguinis，uncultured bacterium，Virgibacillus sp.R-6767，其中后三者在制曲中期消失。从中期到后期优势条带相似性较大，菌群群落结构比较稳定，主要优势菌为：Bacilluslicheniformis，Virgibacillus carmonensis，Bacillus sp.TAT112，Bacillus galactosidilyticus。