重组人乙酰胆碱受体α亚基1-210诱导实验性重症肌无力模型

摘要

背景：重症肌无力(MG)是一种主要累及神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体(AChR)，由乙酰胆碱受体抗体(AchR-ab)介导的自身免疫性疾病。发病率高达8～20/10万，并有逐年上升的趋势；且致残率高，严重危害人类健康，寻找有效治疗手段一直是研究者们努力的方向。实验性重症肌无力(EAMG)是其基础研究的动物模型；构建该模型的经典方法是由电鳗电器管中提取的纯化AchR作为免疫原，电鳗难以捕获，且提取过程复杂、费用昂贵，因此寻找构建该模型的新方法成为当务之急。AChR的主要生物学功能单位是α亚基，它具有高度的免疫原性，有研究证实刺激α亚基或α亚基的某些肽段，可以激活AChR特异反应性T细胞发生免疫反应。用含有免疫表位的α亚基的某些肽段作为免疫原诱导EAMG模型是近几十年来研究者们追求的目标；但可能是由于用作免疫原的肽段多在20个残基左右、免疫位点少、免疫原性较弱、须大剂量重复注射且肌无力存在时间短暂，不能成为理想的动物模型。AchRα亚基的N端细胞外区域1-210位残基，包含了ACh配体的结合位点和主要免疫原区，是MG致病的关键区域，可以推测该肽段有可能成为有效免疫原。九十年代初Talib就应用基因技术分段克隆了hAChRα1-210片段，并在大肠杆菌中诱导表达；构建EAMG模型的知名专家Lennon则以该表达产物免疫Lewis鼠，结果成功诱导EAMG模型。随着分子生物学的发展，应用分子克隆和表达技术重组目的基因的方法已非常成熟；但国内外均未见使用类似方法诱导EAMG模型的报道。 目的：我们首次参照Talib文献克隆并在大肠杆菌中诱导表达了hAChRα1-210，然后用该表达产物免疫Lewis鼠诱导EAMG模型，希望为MG的基础研究提供一个简便、易行的实验动物模型。 方法：本研究参照Talib和Lennon的文献并加以改进，首先RT-PCR扩增出目的基因AChRα1-210片段，然后将构建的表达载体在大肠杆菌中诱导表达，最后将表达产物作SDS-PAGE和免疫鉴定确认为rhAChRα1-210。接着将凝胶上的rAChRα1-210融合蛋白与完全氟氏佐剂(CFA)充分乳化后，按一定的剂量经皮下多点注入6-8周龄雌性Lewis鼠，并在4周后强化接种一次。观察免疫后鼠体重的变化，并给予Lennon临床评分；低频重复电刺激检查电衰减率和ELISA法检测血清AchR-ab滴度作为评价造模是否成功的客观依据。 结果：编码人骨骼肌乙酰胆碱受体α亚基的细胞外区域1-210残基被成功克隆，并被转入一个可诱导的表达载体中，最后在大肠杆菌中大量诱导表达。表达产物经电泳和免疫双重鉴定确认为hAChRα1-210，然后与CFA充分乳化后免疫Lewis鼠。在第二次免疫后约10天实验组鼠出现了体重下降及肌无力，且随着时间延长肌无力症状更加明显。至实验结束时经Lennon临床评分达1级以上者占实验组的70％。低频重复电刺激检查证实该7只实验组鼠的D5比值均超过10％；ELISA法检测血清AchR-ab滴度，有肌无力表现的7只实验鼠均为阳性，对照组有1例可疑阳性，其余均为阴性。 结论：我们应用分子克隆和表达技术重组hAChRα1-210片段，并用该表达产物免疫Lewis鼠，结果成功诱导EAMG模型，成模率为70％。与经典的模型诱导方法相比，该实验具有方法简单、成本较低、免疫原充足等优点。

目录

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英文缩略词表（abbreviation)

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

致谢

综述骨髓间充质干细胞抑制实验性重症肌无力发生的研究进展