转人B7-H3基因鳞癌细胞瘤苗诱导抗肿瘤免疫应答的体外研究

摘要

目的： 肿瘤细胞提呈抗原给T细胞时，由于表面缺乏共刺激分子的表达，不能起始有效的抗肿瘤免疫应答。为了将共刺激分子导入肿瘤细胞以制备肿瘤疫苗，我们将表达B7-H3基因的真核表达载体pEGFP-C1-B7-H3转染入口腔鳞癌细胞Tca8113中，检测B7-H3基因在转染口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达，进一步研究转人B7-H3基因鳞癌细胞疫苗体外诱导抗肿瘤免疫应答的能力。 方法： 采用脂质体介导法将真核表达质粒pEGFP-C1-B7-H3转染入人鳞癌细胞Tca8113中，转染24h,14d,30d后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，待转染成功后，用RT-PCR检测基因B7-H3在转染细胞中的表达：用Western blot检测其蛋白的表达，经G418筛选后获得稳定高表达克隆。以丝裂霉素C(MMC)处理后，制成肿瘤细胞疫苗，经体外与人外周血淋巴细胞共同培养后，测定淋巴细胞特异性杀伤活性及对淋巴细胞产生细胞因子的影响。 结果： 用Lipofectamine2000细胞转染试剂盒把pEGFP-C1-B7-H3载体转入口腔鳞癌细胞株Tca8113中后，于24h、14d、30d时，在10x20倍倒置显微镜下用荧光观察细胞(光波波长488nm或513nm)，同时与未转染质粒的口腔鳞癌细胞Tca8113做对照。转染B7-H3的Tca8113细胞，经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因，用Trizol从转染了pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113细胞中提取总RNA，然后用RT-PCR检测B7-H3的表达，PCR产物电泳结果表明，扩增产物的大小约215bp，与预期的大小一致。转染空载体pEGFP-C1的Tca8113细胞中，没有检测到215bp的PCR产物。用Western blot方法抽提B7-H3/Tca8113基因转染细胞，裂解已转染pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113细胞(B7-H3/Tca8113)的基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约84～90KD大小的特异性条带；而mock/Tca811没有特异性条带。经过G418筛选后挑取单克隆法建立了B7-H3/Tca8113细胞株。转染B7-H3的Tca8113细胞能够高表达B7-H3蛋白。经MMC处理后，与野生型的Tca8113细胞相比，上述瘤苗对T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可促进其体外增殖，诱导淋巴细胞产生针对Tca8113的特异性杀伤作用，能显著增强淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。 结论： 用脂质体法把真核表达载体pEGFP-C1-B7-H3转染到口腔鳞癌细胞Tca8113中，用挑选单克隆法建立了稳定表达B7-H3蛋白的细胞株，用RT-PCR及Westernblot鉴定B7-H3基因在该细胞中有表达。B7-H3/Tca8113经MMC处理后得到TCV-hB7-H3，将其与T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可促进其体外增殖，诱导淋巴细胞产生针对Tca8113的特异性杀伤作用，能显著增强淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。转B7-H3基因人鳞癌细胞疫苗能诱导有效的抗鳞癌免疫反应。为以后在体内试验中研究B7-H3对免疫细胞的调节和肿瘤基因治疗奠定了基础。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

6展望

参考文献

附录：个人简历

致谢

B7-H3在肿瘤免疫治疗中的应用