霍乱弧菌O139血清群mshA基因的克隆、表达及其融合蛋白免疫性的初步研究

摘要

霍乱是一种烈性肠道传染病，是我国传染病防治法规定的甲类传染病。霍乱弧菌被分为200多个血清群，其中只有01和0139群能引起霍乱大流行，0139霍乱弧菌(VC0139)是0139霍乱的病原体。霍乱流行菌已转为0139型为主，浙江等地时有散发病例。国内外不少学者发现菌毛与霍乱弧菌的粘附定居有关，其中甘露糖敏感血凝素(Mannose-SensitiveHemagglutinin,MSHA)属于IV型菌毛，决定IV型菌毛的血凝活性。MSHA为一免疫原，同时在霍乱弧菌在环境中存活方面起着特殊作用。主要由霍乱弧菌ElTor生物型和0139产生，古典生物型存在其结构基因mshA但仅以极低水平表达并不产生MSHA。霍乱弧菌E1Tor生物型N16961msba基因长536bp，编码178个氨基酸，0139：该基因序列与之一致。 本研究构建重组质粒pET28a(+)一mshA-BL21(DE3)，采用组氨酸标签融合表达rMSHA蛋白，经Ni-NTA亲和层析法纯化，纯化的rMSHA蛋白免疫日本大耳兔制备抗体，采用间接ELISA法分析所制备抗体并检测病人血清MSHA抗体。：本研究为进一步研究MSHA的免疫学活性，以期为研制霍乱弧菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定基础。 方法 1．霍乱弧菌0139的分离鉴定及基因组DNA提取 采用常规的酚．氯仿法提取0139菌株基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度；根据霍乱弧菌0139编码荚膜多糖的一特异基因rfbS，设计特异引物进行PCR扩增并测定扩增产物序列从而鉴定临床分离菌株。 2．mshA基因的扩增 根据GenBank公布mshA基因序列，设计巢式引物并在内引物中引入酶切位点(Nco，和XhoI)，高保真PCR方法扩增目的基因。 3．T-A克隆及表达载体的构建 采用TaKaRa公司的T-A克隆试剂盒将扩增的目的片段克隆至pMDl8-T载体中，转化于EcoliDH5a并扩增，碱裂解法提取质粒。获得满意的测序结果后，提取质粒pMDl8-T-rash,,1，双酶切pMDl8-T-mshA获得目的基因和同样双酶切处理的pET28a(+)连接后转化3E．coliDH5a，提取质粒(pET28a(+)．mshA)后再次测序，并用生物学软件与报道的mshA基因核苷酸序列进行同源性比较。 4．重组蛋白的表达及纯化 将重组原核表达载体转化E．coliBL21(DE3)，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，在大肠杆菌内表达目的蛋白；超声裂解细菌提取蛋白质，通过SDS-PAGE分析蛋白表达量；以His．Tag单克隆抗体为一抗WesternBlot分析重组蛋白的免疫反应性：Ni-NTA亲和层析法收集表达的带His．Tag的目的蛋白。 5．多克隆抗体的制备及分析 用纯化的目的蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体，WesternBlot检测重组蛋白的免疫原性；ELISA测定该抗体的效价并检测霍乱病人血清中的抗体。 结果 1．霍乱弧菌0139的分离鉴定 PCR扩增经测序证实获得预期大小的0139特异片段rfbS，该分离菌株为霍乱弧菌0139。 2．mshA基因的扩增 从VC0139菌株DNA模板中高保真巢式PCR获得预期大小的msbaflanks(842bp)和mshA(561bp)扩增片段。 3．T-A克隆及表达载体的构建 pMDl8-T和pET28a(+)重组质粒中的mshA基因核苷酸序列完全相同，但在pET28a(+)中融合了His．Tag。测序结果表明克隆的mshA基因的序列与GenBank公布序列完全一致，融合部分与引物设计完全一致，片段共长561bp。 4．重组蛋白的表达及纯化 0．5mmol／1IPTG在28℃3h以上能很好地诱导rMSHA的表达，表达产物主要存在于菌体超声破碎物离心后的沉淀中；Mr约为20kDa，与预期吻合；表达蛋白量约占细菌总蛋白的25％；WesternBlot结果显示与His．Tag单克隆抗体良好的免疫反应性；反应目的蛋白经超声处理后Ni-NTA亲和层析法纯化，纯度达95％以上。 5．多克隆抗体的制备及分析 WestemBloti证实，兔抗rMSHA抗体能与重组蛋白发生特异性反应；间接ELISA法测定该抗体效价为1：25600，同时检测9例霍乱弧菌0139病人血清OD495吸光度值，与20例正常血清对照结果有显著性差异。 结论 本实验成功地从霍乱弧菌0139菌株中构建了mshA基因的高效原核表达系统，所表达的融合蛋白有良好的抗原性和免疫反应性，可作为霍乱弧菌基因工程疫苗和免疫诊断试剂盒的抗原。

目录

前 言

材料与方法

结 果

分析与讨论

小 结

参考文献

附 录

致 谢

综述：霍乱弧菌甘露糖敏感血凝素研究进展

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