PI3K/AKT/P70途径对哮喘ASMCs增殖的影响及罗红霉素的干预作用

摘要

目的： 1.观察哮喘大鼠肺组织Akt、p70S6K及细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的活性变化，探讨P13K信号转导途径在哮喘大鼠ASMCs增殖中的作用； 2.观察罗红霉素对P13K信号转导途径的影响，探讨罗红霉素抗哮喘的作用机制。 方法：SPF级雄性SD大鼠48只，体重200+10g，随机分为4组：正常对照组(C组)、哮喘组(A组)、WOrtmannin干预组(W组)和罗红霉素干预组(R组)，每组12只。以卵蛋白(OVA)致敏和激发的方法制备大鼠慢性哮喘模型。末次激发24小时后腹腔注射麻醉，股动脉放血处死大鼠。肺组织HE染色，光镜下找到完整的支气管横断面，应用图象分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积(Wat1)、管腔面积(Wat2)、平滑肌外缘内气管面积(Wam1)、平滑肌内缘内气管面积(Wam2)，计算标准化总管壁厚度(Wat)为(Wat1-Wat2)/Pbm，标准化平滑肌厚度(Wam)为(Wam1-Wam2)/Pbm。以免疫组化法检测肺组织中磷酸化Akt(p-Akt)及磷酸化p70S6K(p-p70S6K)表达情况，以Western-blot法检测肺组织中磷酸化Akt及磷酸化p70S6K表达情况，以RT-PCR法检测肺组织中cydinD1mRNA的表达情况。 结果： 1.肺组织HE染色光镜观察：C组大鼠支气管上皮完整，无明显炎症反应，肺组织形态正常；A组大鼠可见支气管上皮脱落，支气管壁和血管壁周围有大量炎性细胞浸润，平滑肌层明显增厚，管腔狭窄；W组、R组炎症反应较轻，气道壁各层(尤其是平滑肌层)厚度较A组明显降低，但较C组仍有增厚。 2.支气管壁厚度(Wat)和平滑肌层厚度(Wam)：C组大鼠Wat为63±7μm2/μm，Wam为18.2±1.5μm2/μm;A组大鼠Wat(92±6μm2/μm)和Wam(31.9±2.3μm2/μm)均较C组明显增高(P＜0.01)；W组Wat和Wam分别为78±5μm2/μm、26.3±2.5μm2/μm，R组Wat和Wam分别为75±5μm2/μm、25.61±3.0μm2/μm，两药物干预组与A组相比之间差异有统计学意义(P＜0.01)，和C组之间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。 3.各组大鼠肺组织p-Akt免疫组化结果比较：p-Akt的阳性定位在胞浆和胞核，主要表达在气道上皮细胞和气道平滑肌细胞。A组阳性表达明显高于C组，W组和R组阳性表达低于A组，但高于C组(P＜0.01)。 4.WesternBlot法检测各组大鼠肺组织的P-Akt表达情况：C组大鼠肺组织p-AktOD值为0.416±0.083；A组OD值(0.958±0.156)较C组明显升高(P＜0.01)；W组OD值为0.636±0.055，R组OD值为0.752±0.056，两药物干预组均较A组明显降低(P＜0.01)，均较C组升高(P＜0.01)。 5.各组大鼠肺组织p-p70S6K免疫组化结果比较：p-p70S6K的阳性定位在胞浆，主要表达在气道上皮细胞和气道平滑肌细胞。A组阳性表达明显高于C组，W组和R组阳性表达明显低于A组，但仍高于C组。 6.WesternBlot法检测各组大鼠肺组织的p-p70S6K蛋白表达情况：C组大鼠肺组织p-p70S6KOD值0.144±0.025；A组OD值(0.642±0.127)较C组明显升高(P＜0.01)；W组OD值为0.253±0.039，R组OD值为0.367±0.035，两药物干预组均较A组明显降低(P＜0.01)，均较C组升高(P＜0.01)。 7.RT-PCR法检测各组大鼠气道平滑肌层cyclinD1mRNA表达情况：C组大鼠肺组织cyclinD1mRNA的OD值为0.493±0.156；A组大鼠OD值(1.671±0.360)较C组明显升高(P＜0.01)，W组大鼠OD值为0.924±0.143，R组大鼠OD值为0.883±0.126，两药物干预组较A组明显降低(P＜0.01)，但仍高于C组(P＜0.01)。 8.相关分析：直线相关分析结果显示：Wat、Wam均与p-Akt蛋白含量呈显著正相关(分别r=0.721，r=0.762，均P＜0.01，n=24)；Wat、Wam均与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(分别r=0.831，r=0.732，均P＜0.01，n=24)；Wat、Wam均与cyclinD1mRNA含量呈显著正相关(分别r=0.742，r=0.766，均P＜0.01，n=48)与和Wam呈显著正相关；p-Akt蛋白含量与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(r=0.789，P＜0.01，n=24)；p-Akt蛋白含量与cyclinD1mRNA含量呈正相关(r=0.846，P＜0.01，n=24)；p-p70S6K蛋白含量与cyclinD1mRNA含量呈正相关(r=0.882，P＜0.01)。 结论： 1.哮喘大鼠肺组织中p-Akt及p-p70S6K表达增加，wortmannin能抑制大鼠ASMCs增殖，表明P13K信号转导途径在哮喘ASMCs增殖中具有重要的作用。 2.CyclinD1在哮喘大鼠肺组织中表达明显增高，与p-Akt及p-p70S6K表达趋势相一致，表明PI3K信号信号转导途径通过激活cyclinD1影响哮喘气道重塑。 3.罗红霉素明显改善哮喘气道重塑，可能部分通过调控P13K信号转导途径。

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综述气道平滑肌细胞增殖和支气管哮喘