耶氏酵母POX5基因的改造及其对γ-癸内酯产量的影响

摘要

γ-癸内酯(gamma-decalaetone，GDL)是一种天然食品香料，随着人们对这种安全的天然食品香料需求日益增加，本文尝试通过基因敲除的手段敲除耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)基因组中的POX5基因，切断代谢途径中消耗γ-癸内酯的一条支路，获得POX5单倍体缺陷菌株，为工业生产中提高γ-癸内酯产量和进行多基因缺失菌种改造奠定基础。
　　 文中使用Cre/loxP系统和KanMX(G418抗性)筛选标记建立了酵母POX5基因的敲除方法。从NCBI网站上查到POX5基因和质粒pUG6的序列信息，设计3对扩增引物以及4对验证引物。其中合成敲除组件的扩增引物游5’末端由60个与POX5基因上下游同源的核苷酸序列组成；3’末端由20个和pUG6质粒上的loxP位点同源的核苷酸序列。验证引物A，D分别位于POX5基因的上下游；B，C位于kanMX标记基因内。扩增引物通过扩增pUG6质粒中的loxP-kanMX-loxP序列组件产生POX5基因敲除序列组件。敲除组件转化到耶氏酵母中后与POX5基因序列上下游同源的60bp序列发生同源重组，最终以loxP-kanMX-loxP取代基因组中的POX5基因并赋予转化子G418抗性。多种PCR方法反复验证为正确的阳性克隆子后，进一步转化携带可赋予Zeocin抗性的质粒pSH65，并在含半乳糖的培养基中诱导质粒pSH65表达Cre重组酶，此酶的表达可以切除两个loxP位点间的kanMX标记基因，导致成功切除KanMX的菌株会失去G418抗性。
　　 PCR检验中不仅发现了POX5单倍体缺陷型菌株，而且发现了有部分耶氏酵母菌突变为二倍体，将突变菌在适宜的McClary产孢培养基上诱导二倍体产孢，用2％的蜗牛酶将子囊壁破裂，释放孢子，筛选成功缺失POX5基因的单倍体耶氏酵母菌。成功菌传代培养，诱导质粒pSH65丢失，最终得到POX5单倍体缺陷型菌株。
　　 成功菌株经发酵培养后，气相色谱法测定发酵液中GDL含量。与原始耶氏酵母菌比较，耶罗维亚酵母POX5单倍体缺陷型菌株本身并没有提高γ-癸内酯产量，但是可以作为下一步与其他基因进行组合缺失的出发菌。