IP在UTP调节猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道中作用的研究

摘要

目的:血管平滑肌细胞膜上的大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels，BKca)在血管舒缩调控机制中起着重要的作用。平滑肌细胞肌浆网上三磷酸肌醇受体(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)和兰诺定受体(ryanodine receptors，RyRs)介导的Ca2+释放可引起细胞内局部[ca2+]i显著增加，激活邻近胞膜上BKCa通道的开放产生自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents，STOCs)，进而引起细胞膜超极化，电压依赖性Ca2+内流减少，负反馈调节平滑肌的收缩。目前多数研究已证实在血管平滑肌中，RyR介导的钙释放是激活BKca通道开放产生STOCs的最终通路，而作为胞内第二信使的三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3)与甘油二酯(diacylglycel，DG)在对BKca通道的调控中也发挥了重要作用。前期研究已证实在inside-out膜片下，IP3对猪冠状动脉平滑肌细胞BKca通道的单通道活性具有激活作用；在全细胞构型下，三磷酸尿嘧啶核酸(uridine5'-triphosphate，UTP)诱导细胞产生的IP3与DG参与了STOCs的调节，并具有重要的生理意义。由于单通道记录方法中，细胞贴附式(cell-attached)对细胞的结构和内在环境的干扰最小，在该膜片形式下记录到的单通道的活动较其它形式更接近生理条件；因此本实验采用单通道膜片钳技术，在cell-attached膜片上，进一步研究UTP对急性酶分离的猪冠脉平滑肌细胞BKca通道的作用，并探讨生理条件下UTP诱导产生的IP3对BKca通道的作用及其机制，为深入研究血管舒缩及调控机制提供实验依据。方法:分离新鲜猪心的冠状动脉血管的二级分支，纵向剖开并斜行剪成2mmx5mm的组织条块，置于酶液中进行两步法消化。选取贴壁良好，折光性强，具有较强立体感，表面光滑的平滑肌细胞进行实验。取细胞置于对称性高钾溶液([K+]o:[K+]i=140:140mM)中，用膜片钳技术记录单通道电流，所得电流通过膜片钳放大器(CEZ-2300)放大，滤波(1KHz)后输入计算机，用pCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。将膜电位钳制于+40mV，在cell-attached膜片上观察BKca通道电流的变化。实验方案如下:①研究UTP对BKca通道的作用。②用UTP预处理细胞后，加入磷脂酶C(phospholipase C，PLC)抑制剂U73122，探讨PLC在UTP调控BKca通道中的作用。③加入PK.C特异性激动剂PMA；而在另一组实验中用UTP预处理细胞，再加入PKC特异性抑制剂Bis-I，研究DG/PKC信使通路对UTP调控BKca通道的影响。④加入IP3R特异性抑制剂2APB，进一步研究IP3/ca2+通路在UTP调控BKca通道活动中的意义。⑤记录了药物作用前后的通道电流后，灌流浴液5-7次，待通道电流变化稳定后，在cell-attached膜片基础上形成inside-out膜片，并在此膜片上观察和鉴别BKca通道的特性。结果:1. 在对称性高钾溶液中，在inside-out膜片上，猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道电导值为229.5±8.1pS(n=20)，通道具有电压依赖性和钙敏感性，以及明显的钾离子选择性，400nM的ChTX能够完全阻断通道活动。2.在cell-attached膜片上，80μMUTP可明显激活BKCa通道:BKCa通道开放概率增加，关闭时间缩短(P<0.01，n=21)。3.UTP(80μM)预处理细胞之后，再向浴液中加入磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122(10μM)可使通道开放概率减小，通道开放时间缩短，关闭时间延长(P<0.05，n=5)。4.浴液中加入PKC激动剂PMA(10nM)，BKCa通道开放概率明显降低((P<0.05，n=6)。5.用UTP(80μM)预处理细胞，再向浴液中加入PKC特异性抑制剂Bis-I(1μM)，BKCa通道开放概率较加入前明显增大(P<0.05，n=6)。6.用UTP(80μM)预处理细胞，再向浴液中加入IP3R抑制剂2APB(80μM)， BKCa通道开放概率降低，通道活动受抑制(P<0.05，n=6)。结论:1.在cell-attached膜片上，UTP能激活猪冠脉平滑肌细胞BKCa通道。2.UTP对BKCa通道的激活作用是通过胞内PLC信使转导通路实现的。3.激活DG/PKC通路中的PKC可以在一定程度上抑制UTP对BKCa通道的激活作用，导致BKCa通道开放受抑。提示UTP对BKCa通道的激活并不是通过DG/PKC信号通路来介导的。4.抑制IP3/Ca2+信使通路，BKCa通道的开放受到明显的抑制。提示PLC信使转导通路中的IP3介导的胞内Ca2+释放是UTP激活BKCa通道的重要途径。

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