IP及DG信使通路在UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞STOCs调节中的作用

摘要

目的：大电导钙激活钾通道(1arge-conductancecalcium-activatedpotassiumchannels，BKCa)在调节血管平滑肌舒张机制中起着重要作用。由胞内肌浆网(sarcoplasmicreticulum，SR)上兰诺定受体(ryanodinereceptor,RyR)通道开放产生的钙火花(Ca2+sparks)可使局部钙浓度迅速升高，激活胞膜上许多与之相邻的BKca通道产生自发性瞬时外向钾电流(spontaneoustransientoutwardcurrents，STOCs)，使膜超极化，抑制电压依赖性钙通道(voltage-dependentCa2+channels，VDCC)，减少钙内流，负反馈抑制平滑肌的收缩。由于生理状态下BKCa道对Ca2+的亲和力低，而全胞性钙浓度较低且变化有限，因此由钙火花激活邻近的部分BKca通道开放产生的STOCs在血管平滑肌收缩舒张的调节中发挥着极为重要的作用。血管平滑肌中，RyR产生的钙火花可激活相邻的BKCa通道产生STOCs已被大家所公认。但近年来的研究显示，三磷酸肌醇(inositoll，4，5-triphosphate，IP3)与甘油二酯(diacylglycel，DG)作为胞内重要的第二信使在STOCs产生及调控中也发挥了重要的作用，而具体机制尚不十分清楚。另外，二者在收缩或舒张物质对于STOCs的调控中分别发挥着怎样的作用还存在许多争论，需要进一步研究。迄今己发现100多种细胞外因子可通过磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)产生的IP3及DG信使通路调节细胞功能，因此深入研究双信使通路对BKca通道的调节机制具有重要的生理意义。本课题以与人心脏构成相似、容易获取的猪冠脉平滑肌为研究对象，观察猪冠状动脉平滑肌细胞上的STOCs，以及三磷酸尿苷(uridine5'-triphosphate，UTP)介导产生的IP3与DG在UTP对STOCs调节中的作用，并初步探讨其机制。为深入认识血管舒缩及调控机制提供实验依据。 方法：分离出猪冠状动脉，剔除外膜和内膜，保留平滑肌层，将其剪成2×5mm的组织块，放入酶液经过酶解后获得单个平滑肌细胞，分离的细胞在8小时内使用。取急性酶分离的平滑肌细胞置于浴液中，采用膜片钳技术记录全细胞电流。所得电流通过膜片钳放大器(CEZ-2300)放大，滤波(2KHz)后输入计算机，用pCLAMP9.O软件系统进行数据采集；应用MiniAnalysis6.0软件系统进行数据分析。本实验以全细胞穿孔膜片钳(perforated-patchclamp)方式记录猪冠状动脉平滑肌细胞膜上的STOCs，将测试电位(testpotential，TP)保持在-30mV，观察UTP介导产生的IP3与DG在UTP对STOCs调节中的作用。 结果：①实验条件下记录到的STOCs随电压的增加而增加，有明显的电压依赖性(n=5)，并能被BKca通道的特异性阻断剂卡律蝎毒素(charybdotoxinChTX)完全阻断(n=6)。②5mMRyR的特异性激动剂咖啡因(caffeine)可激活STOCs(n=5)；50μMRyR的特异性阻断剂兰诺定(ryanodine)可使STOCs的幅度和频率均减小直至完全消失(n=16)，在此基础上加入5mMcaffeine未见恢复(n＝9)。③40μM的UTP可使STOCs的幅度与频率明显增加(23.53±2.55pA，0.2167±0.0217Hzvs40.76±5.75pA，0.3695±0.0358Hz，n=16，P＜0.01)，分别增加到加药前的173.20±24.45％和158.88±18.41％；50μM的ryanodine可完全阻断UTP的激活效应(n=8)。反之，50μM的ryanodine预处理后，40μMUTP则无法激活STOCs(n=6)。④1μM的BisI(PKC的特异性阻断剂)可明显增加STOCs的幅度及频率(28.71±3.2pA，0.25±0.045Hzvs46.32±6.17pA，0.407±0.061Hz，n=12，P＜0.01)；分别增加到加药前的165.44±24.66％和161.35±21.47％。继续加入40μMUTP可使STOCs的幅度及频率进一步增加至65.53±8.34pA和0.6937±0.0597Hz(n=12，P1＜0.05，P2＜O.01)，分别增加到加入UTP前的140.88±19.09％和170.27±14.65％。该效应能被50μMryanodine完全阻断。⑤BisI存在时UTP对STOCs的激活作用明显大于UTP单独存在时的激活作用(17.25±4.43pA，O.1277±0.0234Hz，n=16vs36.82±7.18pA，0.4476±0.0698Hz，n=12，P1＜0.05，P2＜O.01)。 结论：①猪冠状动脉平滑肌细胞上记录到的STOCs具有电压依赖性，并能被BKca通道的特异性阻断剂ChTX所阻断，提示此电流由BKca通道所携带。②胞内肌浆网上的RyR介导的钙释放在STOCs的产生中起重要的作用。③UTP是通过作用于RyR发挥激活STOCs的效应。④PKC的特异性阻断剂BisI存在时，UTP仍可激活STOCs，且激活效应明显大于UTP的单独作用，而50μMryanodine可完全阻断UTP对STOCs的激活作用。本课题的另一部分实验结果显示UTP的激活作用可被PLC的阻滞剂U-73122和IP3R拮抗剂2-APB所阻断，综合两组结果提示：双信使通路参与了UTP调控猪冠状动脉平滑肌细胞STOCs的过程，DG-PKC通路在一定程度上抑制了基础状态下的STOCs以及UTP对STOCs的激活效应，IP3通路在UTP激活STOCs的过程中发挥了重要作用，而RyR介导的钙释放是激活STOCs的最终通路。

目录

摘要

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

致谢

综述 血管平滑肌钙信号研究进展

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