IPR介导的Ca释放和DG-PKC途径在UTP对猪冠状动脉平滑肌舒缩活动调节中的作用

摘要

目的：平滑肌的舒缩活动与胞内Ca2+浓度变化密切相关，高浓度Ca2+引起平滑肌收缩，低浓度Ca2+引起平滑肌舒张。胞内Ca2+浓度的升高来自细胞内钙库Ca2+释放或细胞外Ca2+经质膜上Ca2+通道的进入。肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)是血管平滑肌细胞收缩时可被动员的最重要的钙库。兰诺定受体(ryanodine receptor，RyR)是SR上的钙释放通道，其开放产生的钙火花(Ca2+sparks)可使局部钙浓度迅速升高，激活胞膜上许多与之相邻的BKCa通道产生自发性瞬时外向钾电流(spontaneous transient outward currents，STOCs)，使膜超极化，抑制电压依赖性钙通道(voltage-dependent Ca2+channels，VDCC)，减少钙内流，负反馈抑制平滑肌的收缩。由于生理状态下钙火花对胞浆内总体Ca2+浓度的影响非常小，因此由钙火花激活BKCa通道开放产生的STOCs在血管平滑肌舒缩活动的调节中发挥着极为重要的作用。三磷酸肌醇受体(inositol 1，4，5-triphosphatereceptors，IP3Rs)是SR上的另一种Ca2+释放通道，其开放亦产生局部Ca2+释放(Ca2+puffS)从而参与平滑肌舒缩活动的调控。近年来的研究显示，IP3(IP3R通道的生理性特异性配体)与甘油二酯(diacylglycel，DG)作为胞内重要的第二信使在血管平滑肌舒缩活动的调控中发挥了重要的作用，但具体机制尚不十分清楚。迄今已发现100多种细胞外因子可通过激活磷脂酶C(phospholipase C，PLC)水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphafidyliositol 4，5-biphosphate，PIP2)产生IP3激活IP3R通道及DG-PKC信使途径调节细胞功能。因此深入研究这两条信使途径对血管平滑肌舒缩活动调控的机制具有重要的生理意义。 本实验在前期实验的基础上，联合运用离体猪冠状动脉血管环实验和全细胞膜片钳技术观察5’-三磷酸尿苷(uridine5，-triphosphate，UTP)对离体猪冠状动脉血管环张力的作用以及PKC激动剂氟波醇(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)对猪冠状动脉血管平滑肌细胞STOCs的作用，以探讨IP3诱导IP3Rs通道开放产生的胞内Ca2+释放和DG-PKC途径在UTP对血管舒缩活动作用中的调控机制。 方法： (1)离体猪冠状动脉血管环实验：迅速分离猪心外膜下冠状动脉前降支主干中下1/3置于氧饱和溶液中，将游离血管剪成长约0.3-0.4厘米的血管环，用两根银丝穿过动脉环，将其固定在通95％O2和5％CO2，37℃的温浴中，将张力换能器与多道生理记录仪输入端相连于血管环中。血管环张力经过张力换能器传递至生物信号采集处理系统并显示出数据，获得的数据采用CODAS软件进行分析。观察UTP，2APB(IP3R通道通道阻滞剂)，BisI(DG-PKC途径阻滞剂)等对血管环张力的影响。加药前用乙酰胆碱(acetycholine，Ach)验证血管环内皮细胞是否受损。 (2)膜片钳实验：分离新鲜猪心冠状动脉血管的二级分支，纵向剖开并斜行剪成2mm×5mm的组织条块，置于酶液中进行消化。选取具有较强立体感，表面光滑的平滑肌细胞进行实验，采用全细胞穿孔膜片钳技术记录STOCs的变化。电流信号经膜片钳放大器(EPC10)处理后输入计算机，经Pulse软件采集电流信号，Mini Analysis 6.0软件系统进行电流分析。观察PKC的激动剂PMA对平滑肌细胞STOCs的作用，并进一步研究caffeine对PMA引起的STOCs变化的作用。 结果： (1)UTP对离体猪冠状动脉环张力的作用： ①300μM UTP对未经KC1预处理的冠状动脉环张力无直接作用(60min)(n=6，P>0.05)； ②300μMUTP对3次KC1预处理后末次KC1引发的冠状动脉环收缩无明显加强或减弱作用(60min)(n=6，P>0.05)； ③冠状动脉环经KCl预处理并冲洗后，初始张力平衡在1.0g，300μM UTP加强此时的初始张力，张力增加0.36±0.07g(约20min后张力稳定，观察60min)(n=30，P<0.01)。 (2)2APB对UTP引发的冠状动脉环(经KC1预处理并冲洗)收缩的作用： ①300μM 2APB最初明显加强UTP引起的收缩，张力增加0.11±0.04g(n=6，P<0.05)；张力增加到最大值(约10min)后开始缓慢下降，最终明显减弱UTP引起的收缩(40～60min)，张力减少0.18±0.06g(n=6，P<0.05)； ②600pM 2APB先明显增加UTP引起的收缩(约10min)，张力增加0.26±0.10g(n=6，P<0.05)；后张力下降并最终减弱UTP引起的收缩(40-60min)，张力减少0.35±0.11g(n=6，P<0.05)。 (3)2APB对冠状动脉血管环(经KC1预处理并冲洗)基础张力的影响：300μM 2APB先明显增加(10min内)后缓慢降低(30-40min)动脉环张力，但最终稳定时的张力明显高于基础张力(1.0g)，张力增加0.34±0.02g(n=6，P<0.05)；300μM UTP加强2APB引发的血管环收缩，张力增加0.31±0.08g(n=6，P<0.05)。 (4)7.5μMBisI减弱UTP引发的冠状动脉环(经KC1预处理并冲洗)收缩，张力减少0.25±0.09g(n=6，P<0.05)。 (5)PKC的激动剂(PMA)对STOCs的作用： ①10nM PMA对基础STOCs的幅值和频率有明显抑制作用，加入PMA前后STOCs的幅值和频率分别降低了11.74±2.74pA和0.30±0.07Hz(n=10，P<0.01)； ②1mM caffeine对PMA引起的基础STOCs幅值和频率的降低无明显直接作用(n=6，P>0.05)。 结论： (1)UTP对基础张力状态下的离体猪冠状动脉血管环无直接作用，UTP对KCl引发的冠状动脉血管环收缩无直接舒缩作用，但UTP引起KCl预处理后的冠状动脉血管环收缩，SR内Ca2+超载可能在UTP的这种效应中起到重要作用。 (2)IP3R通道阻滞剂2APB最初迅速加强UTP引发的冠状动脉环收缩反应，最终缓慢减弱UTP引发的冠状动脉环收缩反应。这可能是UTP经PLC-IP3激活IP3R通道介导的胞内Ca2+释放激活了STOCs，参与对血管平滑肌张力的负向调节作用；但UTP经PLC-IP3激活IP3R通道介导的胞内Ca2+释放最终升高胞浆总体[Ca2+]i，引发收缩。 (3)在无UTP作用时，IP3R通道阻滞剂2APB明显收缩基础状态的冠状动脉环。这提示IP3R通道介导的Ca2+释放在无促效剂作用时(即自发性的IP3R通道介导的Ca2+释放)对维持血管平滑肌基础张力有负向调节作用，促进舒张；IP3R通道介导的Ca2+释放激活STOCs可能参与这个调节过程。 (4)DG-PKC途径在UTP引起的猪冠状动脉环的收缩反应中有促进作用，PKC抑制离体猪冠状动脉平滑肌细胞的STOCs参与这种作用。

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综述 平滑肌细胞内的钙释放通道：IP3R