舒肝颗粒对大鼠肝星状细胞α-SMA、TNF-α、TGF-β表达的影响

摘要

目的：研究舒肝颗粒针对肝纤维化防治作用的机制。为了探讨舒肝颗粒对肝纤维化（HF）的逆转是否有作用，我们采用舒肝颗粒作用于体外培养的大鼠肝星状细胞（HSC），研究其对HSCα-平滑肌动蛋白（Smooth muscle actin，α-SMA）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）表达的影响，以探讨舒肝颗粒对HSC增殖与活化的影响及相关机制，为舒肝颗粒临床应用提供进一步理论依据。 方法：将肝星状细胞培养于含10%特级胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2孵箱中培养。采用MTT法测舒肝颗粒不同浓度组（0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml）对细胞增殖情况的影响，根据结果将后续试验分组为空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组和肝颗粒0.04mg/ml组，干预体外培养的HSC24小时后，镜下观察各组细胞形态，用免疫组化法测定各组HSCα-SMA表达情况，用放射免疫法测定各组HSC TNF-α表达情况，用荧光定量PCR法测定各组HSC TGF-β1表达情况。 结果：1.舒肝颗粒四个浓度组的MTTOD值均低于空白对照组，0.01mg/ml与空白对照组之间HSC增殖差异无显著性意义（P>0.05），其余各组与空白对照组之间HSC增殖差异有显著性意义（P<0.05）。2.镜下观察四组细胞：空白对照组HSC胞体扁平，伸展成膜状，呈肌成纤维细胞的改变；舒肝颗粒0.01mg/ml组，胞体伸展稍被抑制，胞体呈星形；舒肝颗粒0.02mg/ml组，HSC细胞形态介于舒肝颗粒0.01mg/ml组与舒肝颗粒0.04mg/ml组之间；舒肝颗粒0.04mg/ml组，能明显抑制细胞体伸展，胞体近梭形，类似于静止期形态。各组均未见核固缩或凋亡现象。3.免疫组化法检测各组α-SMA表达情况：α-SMA在各组均有表达，采用计算机图像分析系统免疫组织化学图像分析软件，所取参数为阳性细胞数计数比率。阳性信号为棕黄色或棕褐色，位于细胞浆的线粒体膜、内质网膜上，阴性组织呈现蓝色。同一盖玻片，取200×高倍视野下α-SMA显色摄取图像，用细胞计数软件作定量分析代表阳性细胞计数比率。空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组及舒肝颗粒0.04mg/ml组阳性表达率用均数±标准差表示分别为（62.83±3.42）%、（47.31±2.74）%、（37.79±3.01）%、（25.74±2.83）%，各组与空白对照组相比较差异有统计学意义（P<0.01）。4.放射免疫法测各组TNF-α水平结果显示：空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组和肝颗粒0.04mg/ml组TNF-α含量用均数±标准差表示分别为：（2.44±0.54）ng/ml、（2.13±0.35）ng/ml、（1.92±0.33）ng/ml和（1.37±0.35）ng/ml，空白对照组与舒肝颗粒0.01mg/ml组两组差异无统计学意义（P>0.05），空白对照组与舒肝颗粒0.02mg/ml组、0.04mg/ml组组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。5.荧光定量PCR法测各组TGF-β1的表达情况：空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组及舒肝颗粒0.04mg/ml组TGF-β1表达水平通过计算2-△△Ct值用均数±标准差表示分别为：（1.00±0.09）、（0.71±0.08）、（0.55±0.07）、（0.44±0.03），且组间差异有统计学意义（P<0.01）。 结论：1.舒肝颗粒可能通过抑制HSC增殖而起到抗纤维化作用，且抑制程度与药物剂量呈一定依赖关系。2.舒肝颗粒可抑制HSC活化，对α-SMA的蛋白表达有明显抑制作用。3.舒肝颗粒可抑制HSC TNF-α表达。4.舒肝颗粒可抑制HSC TGF-β1表达。

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综述 中药对抑制肝星状细胞活化作用的研究进展