急性胰腺炎大鼠胰床毛细血管ZO-1蛋白的表达及早期腹腔引流对其影响的实验研究

摘要

目的:
　　急性胰腺炎(Acutepancreatitis，AP)是由胰腺作为始动器官，引起的一系列瀑布式的、多器官组织的病理改变，毛细血管通透性的改变在此过程中充当着十分重要的传递及放大作用，本研究以胰床毛细血管为窗口，选择紧密连接蛋白ZO-1蛋白为反应毛细血管通透性的指标，探讨急性胰腺炎时大鼠胰床毛细血管内皮细胞表达ZO-1蛋白变化及其与毛细血管通透性改变的关系，并将临床上治疗重症急性胰腺炎(Severeacutepancreatitis，SAP)应用较广、技术成熟的腹腔置管引流转化为大鼠模型，在寻找可能导致ZO-1蛋白变化因素的同时探究早期腹腔引流对急性胰腺炎大鼠干预影响可能的作用机制。
　　方法:
　　本研究以健康SPF级雄性Wistar大鼠为实验动物，体重200-250g，适应性喂养1周后将120只Wistar大鼠随机分为3组:假手术组（A组），SAP组（B组），SAP引流组（C组），每组40只。并于每组设置术后1h、3h、6h、12h、24h五个时相点，各时相点分配8只。A组行开腹手术，仅翻动胰腺后关腹，B组采用逆行胰胆管5％牛磺胆酸钠(0.1ml/100g)微泵注射法制造SAP模型，确定沿胰管走向出现出血、水肿等征象后关腹，C组在B组基础上即时行腹腔引流，即在大鼠下腹置入引流管，分层关腹后于引流管尾端接引流袋;所有大鼠均给与基本液体治疗，即术后于大鼠背部皮下注射40ml/kg体重37℃生理盐水，每12h注射一次，以背部出现明显皮丘为成功标志，术前12h及术后禁食不禁水。并于手术后1h、3h、6h、12h、24h取大鼠外周静脉血、腹水及胰腺组织，取样前30分钟于股静脉注射5％伊文思蓝(Evan'sBlue，EB)(1ml/1kg).采用ELISA法测定大鼠血清及腹水中的白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、核因子κB(NF-κB)、紧密连接蛋白ZO-1的变化。淀粉酶采用美国Beckman公司全自动生化分析仪检测，胰蛋白酶活性采用分光光度法检测。胰腺毛细血管通透性采用分光光度法检测周围胰腺组织的伊文思蓝浓度实现。记录腹水量。观察12h、24h生存率。胰腺组织作病理切片行HE染色后观察病理变化并行病理评分。免疫组化检测胰床毛细血管ZO-1蛋白表达的变化。
　　结果:
　　1，实验大鼠一般情况:假手术组大鼠术后与术前无明显差异。SAP组大鼠术后精神萎靡，活动量减少，食欲差，尿量少;且随时间延长，上述症状逐渐加重。引流组大鼠术后至6h，基本情况与SAP组大鼠相似，6h后精神较SAP组好，活动量增加，尿量增加，且引流组随引流时间的延长，症状逐渐好转。
　　2，SO组24h总死亡率为0％，SAP组12h死亡率为47.5％、24h总死亡率为67.5％，引流组12h死亡率为12.5％、24h总死亡率为22.5％。
　　3，胰腺组织病理变化:SO组大鼠胰腺组织较正常无明显异常;SAP组大鼠胰腺组织早期水肿明显，出现点状出血、散在坏死灶、少量中性粒细胞浸润，随时间延长，镜下可见腺泡小叶结构破坏、实质出血、片状坏死、大量中性粒细胞和单核细胞浸润;引流组胰腺组织术后3h可见胰腺充血水肿，但较SAP组稍轻，6-12h胰腺充血水肿明显，胰腺局部点状坏死，少量间质炎性细胞浸润，24h胰腺充血水肿减轻、坏死程度减轻。
　　4，实验各组血清及腹水中TNF-α、NF-κB、IL-8的表达水平变化:SAP组大鼠血清中TNF-α、NF-κB、IL-8的表达水平较SO组及引流组显著升高(p＜0.05);SAP组大鼠腹水中TNF-α、NF-κB、IL-8的表达水平明显高于引流组(p＜0.05)。
　　5，实验各组血清及腹水中胰淀粉酶和胰蛋白酶表达水平的变化:血清中胰淀粉酶活性SAP组和引流组均高于SO组(p＜0.05)，SAP组腹水中淀粉酶明显高于引流组(p＜0.05)，血清中胰蛋白酶活性SAP组高于引流组，而腹水中胰蛋白酶活性6h时SAP组高于引流组，12h后引流组高于SAP组(p＜0.05)。
　　6，实验各组ZO-1表达水平的变化:SAP组及引流组血清中ZO-1蛋白浓度明显高于SO组(p＜0.05);腹水及血清中ZO-1蛋白的浓度SAP组均高于引流组(p＜0.05)，且随时间推移，SAP组腹水及血清中ZO-1蛋白浓度逐渐升高，引流组腹水及血清中ZO-1蛋白浓度逐渐降低(p＜0.05);胰床毛细血管壁ZO-1蛋白的表达引流组明显高于SAP组(p＜0.05);血清中ZO-1蛋白与胰蛋白酶、淀粉酶和TNF-α浓度正相关，其中与淀粉酶正相关系数为0.87，P＜0.05，与胰腺组织损害程度也呈明显正相关(Pearson相关系数0.96，P＜0.05)。
　　7，胰床毛细血管通透性变化:毛细血管周围胰腺组织的EB含量为SAP高于引流组(p＜0.05)，随时间发展，SAP组周围胰腺组织EB含量逐渐升高，引流组逐渐降低;引流组腹水量子各时相点均少于SAP组。
　　结论:
　　1，大鼠重症急性胰腺炎时，胰蛋白酶及TNF-α作为胰腺炎的早期使动因素，在AP早期就有明显的变化，随后血清中ZO-1蛋白升高，并且贯穿AP大鼠始终，主要来源考虑为毛细血管壁上ZO-1蛋白的破坏脱落，结合相关的文献，这可能与高浓度的胰蛋白酶及TNF-α破坏、抑制ZO-1蛋白的表达有关。
　　2，随着ZO-1蛋白在组织中的表达降低，毛细血管的连续性、完整性遭到破坏，毛细血管的通透性增高，渗出增多。
　　3，早期引流可以通过物理减量的方式明显使腹水中胰蛋白酶、TNF-α、NF-κB、IL-8等因子浓度降低，从而降低了血循环中的毒性因子，减轻了对毛细血管的损伤，保护了毛细血管的屏障功能，降低了大鼠的死亡率。