青岛文昌鱼18SrDNA和L19及S19核糖体蛋白基因定位的研究

摘要

本文首次将荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)用于青岛文昌鱼染色体基因定位研究，确立了青岛文昌鱼染色体荧光原位杂交的技术体系，并且对18S rDNA和核糖体蛋白L19和S19基因进行了染色体基因定位及荧光显带基因定位的研究。 青岛文昌鱼杂交体系为：鲑鱼精DNA超声波打断处理20min；采用5 ng/μL的蛋白酶K处理3～5 min和10 ng/μL RNA酶处理1h进行预处理；封闭DNA采用100～300倍探针浓度的鲑鱼精DNA；50％甲酰胺/2×SSC，1×SSC，2×SSC，42℃的洗脱严紧度；3％BSA进行抗体封闭；杂交温度保持37℃；杂交时间可以控制在12～18 h之内；PI复染量20μl/片。 青岛文昌鱼18S rDNA染色体FISH基因定位信号数为2～6个，主要分布于4条染色体上：1号染色体近着丝粒区，2号染色体长臂近末端区，8号染色体长臂中部，12号染色体着丝粒区。同一染色体杂交信号检出频率不同，荧光信号强弱也不同。2号、8号、12号杂交信号较强，1号杂交信号较弱。12号染色体信号检出频率最高，8号次之，1号和2号检出频率较低。在8号和12号染色体的两条同源染色体上均可以同时检测到信号。1号染色体通常只在一条同源染色体上检测rDNA荧光信号。2号染色体因为可能为性染色体，染色体差异较大，因此定位结果也不一致。 青岛文昌鱼染色体荧光显带结果显示DAPI带与文昌鱼C带近似，表明文昌鱼染色体异染色质区含AT碱基高；PI-R带显带与常规R显带带型基本一致，表明文昌鱼R显带与GC含量相关。18SrDNA荧光显带FISH定位结果显示，杂交信号位于DAPI带2q17，8q12，12q11带；PI-R带1q11，2Aq24，2A'q24，8q13，12q11带。 核糖体蛋白RPL19和RPS19定位结果均显示一对信号。RPL19基因初步定位结果显示存在于4号染色体末端。

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论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

1.1荧光原位杂交技术及其发展应用

1.1.1荧光原位杂交技术的原理与基本流程

1.1.2荧光原位杂交技术的发展

1.1.3荧光原位杂交技术的应用

1.2染色体研究方法概述

1.2.1染色体染色方法

1.2.2染色体数目及核型分析

1.2.3染色体显带研究

1.2.4染色体基因定位研究

1.3 rDNA基因定位及协同进化

1.3.1 rDNA基因单元的基本结构

1.3.2 rDNA基因定位

1.3.3 rDNA基因染色体分布位点的多态性

1.3.4 rDNA基因簇与协同进化

1.4核糖体蛋白研究概况

1.4.1核糖体蛋白在核糖体中的分布

1.4.2核糖体蛋白的功能

1.4.3核糖体蛋白基因和rDNA表达之间的关系

1.5文昌鱼及其染色体研究进展

1.5.1文昌鱼生物学地位及科学和经济研究价值

1.5.2文昌鱼分布和生活条件

1.5.3文昌鱼研究现状

1.5.4文昌鱼染色体研究进展

第二章青岛文昌鱼染色体制片

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2试剂配制

2.1.3方法

2.2结果

2.3讨论

2.3.1影响染色体制片的因素

2.3.2影响染色体中期相的因素

第三章青岛文昌鱼染色体FISH基因定位条件的确立

3.1材料和试剂

3.1.1材料

3.1.2主要试剂及配置

3.2方法

3.2.1探针制备及标记

3.2.2鲑鱼精DNA的处理

3.2.3探针缓冲液

3.2.4探针及标本变性

3.2.5标本预处理

3.2.6杂交

3.2.7杂交后洗脱

3.2.8信号检测及图像处理

3.3结果

3.3.1鲑鱼精DNA处理结果

3.3.2染色体制片预处理对照

3.3.3不同的鲑鱼精DNA浓度对杂交信号的影响

3.3.4不同的洗脱严紧度对杂交信号的影响

3.3.5 BSA封闭对杂交信号的影响

3.3.6 PI量对杂交信号的影响

3.4讨论

3.4.1鲑鱼精处理方法讨论

3.4.2青岛文昌鱼FISH流程的建立

3.4.3荧光原位杂交过程中部分技术问题的探讨

第四章青岛文昌鱼18SrDNA染色体基因定位

4.1材料和试剂

4.1.1材料

4.2.2主要试剂配置

4.2方法

4.2.1 18S rDNA染色体FISH流程

4.2.2 DAPI显带与18S rDNA基因定位

4.2.3 PI-R显带与18S rDNA基因定位

4.2结果

4.2.1 18S rDNA检出信号频率

4.2.2检出信号位点数及分布的染色体号数

4.2.3 DAPI显带结果与18SrDNA基因定位

4.2.4 PI-R带显带结果与18SrDNA基因定位结果

4.3讨论

4.3.1 rDNA的位点数多态性

4.3.2 rDNA定位结果与NORs的相关性

4.3.3荧光显带与基因定位

第五章青岛文昌鱼L19和S19核糖体蛋白染色体基因定位初步研究

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果

5.3讨论

结论

参考文献

致 谢