生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究

摘要

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类广泛存在于自然界的对人类安全的生防细菌，对多种植物病原菌具有拮抗性，而且具有很强的环境适应性，能够产生耐热、抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、加工和储存，是一种理想的生防细菌。
　　 本论文以前期筛选到的生防细菌——枯草芽孢杆菌B579为研究对象，利用摇瓶发酵对枯草芽孢杆菌B579种子的培养进行了研究。以BYP培养基作为种子培养基，较佳的种子培养条件为:种龄14h，接种量7％。摇瓶发酵过程中最适pH为7.0。
　　 对枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵补料策略及补料量进行了优化，结果表明摇瓶发酵条件下葡萄糖反馈补料是最佳补料策略，在发酵的过程中控制葡萄糖浓度为3.0g/L-6.0 g/L，发酵结束菌体浓度为9.5×109 CFU/mL，为优化前的1.9倍。为了得到较优的芽孢生成条件，本论文采用LB培养基建立了两步发酵控制策略，在第一阶段(0-10 h)促进菌体生长，第二阶段(10 h-30 h)促进芽孢生成。分别考察了培养基初始葡萄糖浓度、发酵过程pH、第二阶段摇床转速、第二阶段发酵温度对芽孢生成的影响。利用正交实验确定了获得高浓度芽孢的最佳发酵条件为:培养基初始葡萄糖浓度5.0 g/L，发酵过程pH7.0，第一阶段的培养温度37℃，摇床转速180 r/min，第二阶段发酵温度40℃，摇床转速为200 r/min。此条件下发酵30h后获得的芽孢浓度为9.4×108 CFU/mL，芽孢生成率为91.0％，分别是优化前的6.7倍和2.4倍。其中培养基初始葡萄糖浓度是影响芽孢生成的显著因素。
　　 在摇瓶发酵研究的基础上进行7L发酵罐分批发酵，在温度37℃，pH为7.0条件下，发酵30 h，菌体浓度为1.1×1010 CFU/mL。在温度37℃条件下，进行补料-分批发酵，发酵过程中调节pH维持在7.0，溶氧为10％左右，发酵过程中补加葡萄糖，使葡萄糖浓度保持在3.0-6.0 g/L，发酵35h，菌体浓度达到了3.9×1010 CFU/mL，是分批发酵菌体浓度的3.8倍。将优化后芽孢生成条件应用于7L发酵罐，发酵结束芽孢浓度达到了2.8×1010 CFU/mL，芽孢生成率为75％。
　　 采用喷雾干燥法制备了枯草芽孢杆菌B579粉制剂，并利用杯碟法对其抑菌效果进行了比较。温室盆栽实验表明B579处理使黄瓜的出苗率提高了15％，苗期株高和鲜重分别增加了40％和30％，植株活力指数增加了49％，对黄瓜枯萎病的生防效果达73.6％，说明生防菌B579不仅可以有效抑制黄瓜枯萎病，而且对黄瓜植株有明显的促生长作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 土传病害

1．2 生防细菌及其种类

1．2．1 Bacillus属细菌

1．2．2 Agrobacterium属细菌

1．2．3 Pseudomonas属细菌

1．2．4 Pasteurella属细菌

1．3 枯草芽孢杆菌抑菌机理

1．3．1 枯草芽孢杆菌的拮抗作用

1．3．2 竞争和定殖作用

1．3．3 诱导抗性

1．3．4 促生长作用

1．4 草芽孢杆菌作为生防因子的研发概况

1．4．1 国外枯草芽孢杆菌的应用状况

1．4．2 国内枯草芽孢杆菌的研究概况

1．5 生防细菌发酵培养的研究

1．5．1 发酵培养基的优化

1．5．2 发酵条件的优化

1．5．3 芽孢生成条件的优化

1．6 枯草芽孢杆菌芽孢的生成

1．6．1 芽孢的生成

1．6．2 芽孢的结构

1．6．3 芽孢的特性

1．6．4 芽孢的用途

1．7 课题研究背景及意义

1．8 本论文的研究内容

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌种培养方法

2．2．2 枯草芽孢杆菌B579接种条件的优化

2．2．3 枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵条件的优化

2．2．4 枯草芽孢杆菌B579芽孢生成条件的优化

2．2．5 金属离子对芽孢生成的影响

2．2．6 发酵罐放大培养

2．2．7 生防菌B579粉制剂的制备

2．2．8 生防菌B579生防效果的研究

2．3 分析方法

2．3．1 菌体浓度的测定

2．3．2 活菌总数的测定

2．3．3 芽孢浓度的测定

2．3．4 芽孢生成率

2．3．5 pH仪测量发酵过程pH

2．3．6 生物传感分析仪测量葡萄糖残糖

2．3．7 总糖的测定-蒽酮比色法

2．3．8 DNS法测发酵液中可溶性还原糖

2．3．9 发酵液氨基氮的测定

2．3．10 病情指数分析

2．4 数据分析及统计

3 结果与讨论

3．1 生防菌B579的菌体形态

3．2 种子培养条件的优化

3．2．1 种子培养基对生防菌B579发酵的影响

3．2．2 接种量对生防菌B579生长的影响

3．2．3 种龄对生防菌B579生长的影响

3．3 生防菌B579摇瓶发酵过程分析

3．4 生防菌B579摇瓶发酵条件的优化

3．4．1 发酵过程中pH的确定

3．4．2 摇瓶补料方式对生防菌B579发酵的影响

3．5 枯草芽孢杆菌B579发酵过程中芽孢生成条件的优化

3．5．1 枯草芽孢杆菌B579在LB培养基中的生长曲线

3．5．2 通过两步控制策略优化芽孢生成条件

3．5．3 金属离子对芽孢生成的影响

3．6 发酵罐放大培养

3．6．1 B579发酵罐分批发酵

3．6．2 发酵罐补料分批发酵

3．6．3 芽孢生成条件的发酵罐放大

3．7 粉制剂活菌数的测定

3．8 生防效果的测定

3．8．1 平板对峙试验

3．8．2 盆栽试验

4 结论

5 展望

参考文献

7 硕士期间发表论文

致谢