TNF-α，IL-1基因多态性与强直性脊柱炎发病机理的研究

摘要

[目的]： 1、检测强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者TNF-α基因启动子-308位点和-857位点基因多态性与AS发病的关系，以及两个位点联合检测对AS诊断的意义。 2、检测强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者IL-RN外显子6上30735位点和31017位点基因多态性与AS发病的关系，以及两个位点联合检测对AS 诊断的意义。 3、检测强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者HLA-B27 基因多态性与AS发病的关系，以及两种实验室检测方法的比较对AS诊断的意义。 4、检测AS患者外周血单核淋巴细胞培养上清中TNF的含量与TNF-α基因启动子位点基因多态性的关系。 [方法]： 1、AS患者的临床分级 AS 病例诊断严格参照1984年纽约修订AS诊断标准，并按CT结果分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级。 2、TNF-α、IL-1RN、HLA-B27 基因多态性的检测 取AS患者和健康对照外周静脉血1ml，1％EDTA 抗凝，盐析法提取基因组 DNA，用 MJ PCR 扩增仪按以下程序扩增：95℃，4 min；然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40个循环，最后72℃5min，扩增产物在玻片进行芯片杂交，在 BaiO BE-2.0 生物芯片识读仪(Cat＃ BSE 01011)的片槽上检测。 3、外周血单核淋巴细胞细胞培养上清中TNF含量的测定 取AS患者和健康对照肝素钠抗凝静脉血，分离外周血T淋巴细胞，吸出一部分血清，其余的进行细胞培养，培养后的上清用ELISA 法检测上清中TNF 细胞因子水平的表达 [结果]： 1、AS患者TNF-α基因多态性与外周血单核淋巴细胞培养上清中TNF含量的综合分析 在AS患者中TNF-α基因启动子的-308位点的等位基因 A 频率显著性高于健康对照组(8％ vs 1.25％)，-308GG基因型频率显著性低于健康对照组(84％vs97.5％)，其差异具有统计学意义(P<0.05)；在 AS 患者中TNF-α的-857C/T 的等位基因T频率显著性高于健康对照组(25％vs 9.52％)，基因型CT频率显著性高于健康对照组(42.59％vs 19.05％)，其差异具有统计学意义(P<0.01)。将-308位点的基因型 GG、GA 和-857 位点的基因型CC、CT 两两组合后发现，在健康人中-308GG/-857CC 组合要显著高于AS患者，其差异具有统计学意义(P<0.01)，在 AS 患者中-308GG/-857CT组合要高于健康对照，差异具有统计学意义(P<0.05)。将AS患者分为早期AS患者(CTⅠ、Ⅱ级)和晚期AS患者(CTⅢ、Ⅳ级)，发现晚期AS患者中外周血未刺激的细胞培养上清中TNF含量显著高于健康对照和早期AS患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，TNF-α-308位点为GG 的患者中未刺激细胞培养上清中TNF的含量要显著高于GA的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α-308位点为GG的晚期AS患者中未刺激细胞培养上清中TNF的含量要显著高于早期AS患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。 2、AS患者IL-1RN 基因多态性分析 AS患者中，IL-1RN的31017G和30735C的等位基因频率(60.42％vs 36.36％，32％vs 17.19％)和基因型频率(43.75％vs 12.12％，64％vs 39.39％)显著性高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。并且发现男性AS患者IL-1RN 的31017C/G 的等位基因频率和基因型频率显著性高于健康对照组(61.84％ vs34.62％，47.37％vs 15.38％；P<0.01)。同时，IL-1RN 的 30735C/31017G 单倍体型在AS患者组中的分布频率要高于对照组中的分布频率，差异具有统计学意义(P<0.01)。在 AS 患者中 30735CT/31017GG 基因型组合频率高于 健康对照(P<0.01)。 3、AS患者HLA-B27基因多态性分析 在AS患者中HLA-B27的B2704基因型频率显著性地超过健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，其中男性基因型频率显著高于健康对照组(P<0.05)，基因芯片技术检测HLA-B27的敏感度为78％，特异度为93.94％；流式细胞法检测HLA-B27敏感度为80％，特异度为96.97％，两种方法检测男性AS患者的敏感性都高于女性，两种方法检测AS患者中的HLA-B27敏感性和特异性的差异并无统计学意义(P>0.05)。 4、AS 患者TNF-α与IL-1 基因多态性的综合分析 取AS患者和健康对照TNF-α基因启动子-308位点(基因型GG和GA)、-857位点(基因型CC、CT、TT)、IL-1 外显子的31017(基因型CC、CG、GG)和30735位点(CT、TT)2～4个位点，对取出位点的可能基因型组合，将AS患者和健康对照按取出的基因型与非基因型组合分别计数进行比较，在健康人中31017CG/857CC、31017CG/308GG 组合要显著高于AS患者，其差异具有统计学意义(P<0.01)。在健康人中308GG/31017CG/857CC、308GG/30735TT/31017CG组合要显著高于AS患者，其差异具有统计学意义(P<0.05)。将 IL-1 30735、IL-131017 和 TNF-857 位点基因型组合后发现，在AS患者中30735CT/31017GG/857CT 组合要显著高于健康人，其差异具有统计学意义(P<0.05)。 [结论]： 1、AS患者TNF-α基因启动子-308位点和-857位点基因多态性与AS发病机制相关。 2、AS患者IL-RN外显子6上30735位点和31017位点基因多态性AS发病有一定的关系。 3、AS患者外周血T淋巴细胞细胞培养上清中的TNF含量增加在AS病情的发生发展起到一定作用。 4、AS患者HLA-B27 基因多态性与AS遗传发病机制相关，HLA-B27的B2704.基因型是中国汉族AS患者的主要基因型并与AS存在显著相关性。

目录

声明

1前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2 AS临床资料分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3 TNF-α基因多态性与外周血单核淋巴细胞中TNF水平的综合分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

4 AS患者易感基因IL-1RN的单核苷酸多态性的研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

5 TNF-α与IL-1基因多态性的综合分析

5.1材料与方法

5.2结果

5.2讨论

6 AS患者经强直性脊柱炎患者HLA-B27检测的的分析

6.1材料与方法

6.2结果

6.3讨论

7小结

参考文献

文献综述　基因多态性与强直性脊柱炎发病相关性的研究进展

致谢

附录