猫眼草HPLC指纹图谱的建立及其相关成分的肠吸收、经皮吸收和药动学研究

摘要

目的：猫眼草为我国中草药，为了能深入地开发利用猫眼草的药用资源，全面了解该药材的临床疗效的物质基础，本次以猫眼草为研究对象，建立其质量控制方法以及对相关成分进行大鼠体外肠吸收、经皮吸收和体内的药物代谢动力学特征研究。
　　方法：
　　（1）从全国各地收集15批不同产地的猫眼草药材，采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，检测波长为254 nm，以甲醇-0.2％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，建立猫眼草的高效液相指纹图谱的方法。采用本方法对15批来源不同产地的猫眼草药材进行指纹图谱的研究，并结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统，聚类分析和主成分分析这两种化学模式识别的方法，从整体上辨识图谱，对来源不同产地不同批次的猫眼草指纹图谱进行分类，区分药材的归属性。
　　（2）采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，检测波长为254 nm，以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，建立高效液相色谱法同时定量分析来源不同产地的15批猫眼草药材中的没食子酸、秦皮乙素、金丝桃苷、槲皮素和山萘酚。
　　（3）采用大鼠离体外翻肠囊法对不同浓度的猫眼草水提取物进行肠吸收特征研究，以没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷为指标性成分，建立HPLC法对肠道孵育后的猫眼草水提取物进行组分分析。计算没食子酸，秦皮乙素和金丝桃苷在大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠四个肠段的单位肠管面积累积吸收量（Q）和吸收速率常数（Ka）以及表观渗透系数（Papp）。
　　（4）采用Franz扩散池，利用离体大鼠皮肤为渗透屏障，以30%乙醇生理盐水为接收液，以没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷为指标性成分，采用HPLC法检测样品，研究猫眼草水提取物的经皮吸收以及加入不同浓度不同的渗透促进剂（氮酮、冰片和丙二醇）的经皮吸收。计算没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷三种成分的累积渗透量、透皮速率、增渗倍率和渗透系数。
　　（5）大鼠灌胃给予猫眼草水提取物低、中、高三个剂量（1.2 g/kg,2.4 g/kg,4.8 g/kg），采用HPLC法，检测大鼠血浆中的没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷的血药浓度，计算相关的药动学参数。
　　结果：
　　（1）建立了猫眼草水提物的HPLC指纹图谱，以金丝桃苷为内参比峰，得到32个共有峰。利用对照品对比的方法，对指纹图谱中5个色谱峰进行了指认，分别鉴定为没食子酸，秦皮乙素，金丝桃苷，槲皮素和山萘酚。对来源于不同产地的15批猫眼草样品得到的指纹图谱数据进行相似度分析，聚类分析和主成分分析。结果显示，来源于不同产地的15批猫眼草相似度在0.886~0.994之间，化学成分含量有一定的差异性，主要分为2类。
　　（2）没食子酸、秦皮乙素、金丝桃苷、槲皮素和山萘酚的线性范围分别为5~250μg/mL（r=0.9999），10~200μg/mL（r=0.9998），20~500μg/mL（r=0.9998），5~80μg/mL（r=0.9999）和2~50μg/mL（r=0.9998）。结果表明，来源于不同产地的猫眼草药材在含量上均有差异性。15批猫眼草药材中没食子酸、秦皮乙素、金丝桃苷、槲皮素、山萘酚量的含量分别为0.16~0.97 mg/g，0.95~1.27 mg/g，1.56~2.04 mg/g，0.32~0.46 mg/g和0.12~0.26 mg/g。该定量分析方法简单、快速、准确。
　　（3）从肠道孵育液中检测的色谱峰与药材的指纹图谱相比较，确定了来源于猫眼草水提取物有17个，其中指认了3个，分别鉴定为没食子酸、秦皮乙素、金丝桃苷，并对这3种成分进行肠吸收属性研究。结果表明，各成分在不同肠段的累积吸收量随样本浓度和时间的增加而增加，其回归相关系数（R2）均达到0.90以上，符合一级吸收速率。秦皮乙素和金丝桃苷在四个肠段的累积吸收量大小为十二指肠>空肠>回肠>结肠。没食子酸在四个肠段的累积吸收量大小为空肠>十二指肠>回肠>结肠。各肠段的没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷的Ka随着猫眼草水提取物浓度的增加而增加。通过分析，在不同浓度的猫眼草水提物的条件下，3种成分的Papp无显著性差异。没食子酸在四个肠段，不同样本浓度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之间，金丝桃苷在十二指，空肠、回肠三个肠段，不同样本浓度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之间，秦皮乙素的Papp在十二指肠和空肠，不同样本浓度的Papp在1×10-6~1×10-5(cm/s)之间。
　　（4）结果显示，在未加入任何渗透促进剂的条件下，猫眼草提取物中的没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷的透皮速率分别0.649μg/cm2/h，0.845μg/cm2/h，2.283μg/cm2/h。加入不同浓度不同渗透促进剂（氮酮、冰片、丙二醇）后，没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷累积渗透量和透皮扩散速率均比未加渗透促进剂提高。透皮速率数据显示，3种成分的释放量与时间成线性关系，相关系数（R2）均在0.90以上，为一级扩散。促渗效果随着促渗剂的浓度增加而增加，单独使用一种促渗透剂在相同的浓度下，各促渗透剂对没食子酸的促渗透效果大小为丙二醇>氮酮>冰片，对秦皮乙素和金丝桃苷的促渗透效果大小均为氮酮>冰片>丙二醇。促渗剂联用使用的促渗效果均比单独使用一种促渗剂高。
　　（5）从大鼠含药血浆中检测出19个峰，其中采用对照品法指认了3个，分别为没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷，并对其进行药物代谢动力学特征研究。没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷分离度良好，内源性物质不干扰其测定。没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷浓度分别在0.02~10μg/mL、0.05~10μg/mL和0.15~180μg/mL范围内，峰面积与血浆浓度均呈良好的线性关系（r>0.9995）。提取回收率均大于90%，批内和批间的RSD均<10%，表明此方法灵敏，符合CFDA有关药物代谢动力学测定实施细则的要求，可用于没食子酸，秦皮乙素和金丝桃苷在血浆中的定量分析。大鼠分别灌胃给予猫眼草水提取物1.2 g/kg,2.4 g/kg和4.8 g/kg三个剂量，没食子酸的Cmax分别为（4.284±0.233） mg/L，（9.028±0.243）mg/L，（18.056±0.487）mg/L，Tmax分别为（1.500±0.000）h，（1.500±0.000）h，（1.500±0.000）h，AUC0-∞分别为（11.639±1.103）mg/L·h，（23.578±1.634）mg/L·h，（47.537±3.777）mg/L·h。秦皮乙素的Cmax分别为（4.005±0.163） mg/L，（7.933±0.346）mg/L，（15.201±0.220）mg/L，Tmax分别为（0.250±0.000）h，（0.250±0.000）h，（0.250±0.000）h，AUC0-∞分别为（14.537±1.949）mg/L·h，（28.679±3.892）mg/L·h，（54.596±2.549）mg/L·h。金丝桃苷的Cmax分别为（3.081±0.134） mg/L，（5.268±0.673）mg/L，（10.083±0.708）mg/L，Tmax分别为（0.500±0.000）h，（0.500±0.000）h，（0.500±0.000）h，AUC0-∞分别为（3.848±0.977）mg/L·h，（5.587±1.000）mg/L·h，（10.725±0.825）mg/L·h。统计学检验显示，在给定的三个剂量范围内，没食子酸、秦皮乙素和金丝桃苷三种成分的药动学具有线性动力学的特征。
　　结论：本研究初步建立了猫眼草水提取物HPLC指纹图谱，并结合多成分定量对猫眼草进行了质量评价，来源于不同产地的猫眼草中的化学成分及其含量均具有一定的差异性，这种差异性的产生可能与植物本身的生长环境，如气温、土质、阳光、降雨量以及采收时间的不同有关。此外，对猫眼草水提物进行大鼠肠吸收，体外经皮吸收和体内药物代谢动力学特征探讨，没食子酸，秦皮乙素和金丝桃苷这三种成分在体内能够吸收进入血液，提示这三种成分可能是猫眼草发挥药理作用的有效成分。这三种成分在肠道的吸收机制可能为被动扩散。本次研究为猫眼草提取物的剂型设计提供理论依据，为该品的新药开发提供一定的实验参考。丰富了中药化学成分的药代动力学研究内容，为猫眼草中药材的质量控制和药物动力学研究做了有意义的探索。