鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28-β亚单位基因克隆、鉴定及时空转录分析

摘要

PA28-α和PA28-β可被IFN-γ诱导，可以激活20S蛋白酶体前体，使之产生抗原肽被MHC Ⅰ类分子识别呈递给细胞毒性T细胞，因此在MHC Ⅰ类抗原呈递中具有重要作用。编码PA28-α和PA28-β的基因PMSE1和PMSE2已在哺乳动物中被很好的鉴定和阐述，而在鱼类方面报道很少。本研究以荧光mRNA差异显示技术获得的含有鲤鱼PA28-β亚单位cDNA3′端部分片段为核酸探针，地高辛标记后，应用核酸杂交法筛选有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库。此外，本研究根据PA28-β亚单位cDNA设计引物，应用半定量。RT-PCR方法，分析了在分离培养的正常白细胞和丝列原刺激的白细胞中该亚单位基因不同时间的转录差异情况，还对PA28-β在正常鲤鱼和嗜水气单胞菌Ahes01刺激后鲤鱼的组织转录情况进行了分析。结果显示：我们获得的鲤鱼PA28-β亚单位cDNA克隆全长1175bp，GenBank获得注册号为EU255233，含有5′非翻译区和3′非翻译区及3′poly(A)加尾信号(AATAAA)和poly(A)尾巴，中间是732bp大小编码244个氨基酸的开放阅读框。推测的蛋白序列与斑马鱼、石首鱼、比目鱼、河豚、短尾猊、狗、猕猴、牛、人和非洲蟾蜍的PA28-β同源性分别为95％、78％、73％、70％、65％、63％、63％、63％、63％和55％，在相同的进化距离下比较哺乳动物和鱼类，人、猩猩、猪、狗等哺乳动物保守序列比例约占70％，而鱼类则相对较低，与哺乳动物比较约只有30％保守，说明鱼类的分子进化要比哺乳动物快，鲤鱼与石首鱼、比目鱼、河豚相比，和斑马鱼的亲缘关系更大，这可能是鲤鱼和斑马鱼同属淡水鱼而石首鱼、比目鱼和河豚属于海水鱼的原因了。蛋白质序列比对显示鲤鱼PA28-β蛋白序列中同样含有KEKE基序、内质网膜保留信号KPSM、典型的富含脯氨酸基序、可能的蛋白激酶C识别位点、高度保守的激活环和高度同源的C末端区域5个哺乳动物中存在的保守功能区域：时间转录分析显示：丝裂原刺激白细胞中PA28-β转录增强，尤其是ConA刺激后增强尤为显著，但是随着时间的延长增强幅度有下降趋势，提示PA28-β的转录对于不同的诱导物敏感程度不同，也说明PA28-β可能在细胞受刺激早期发挥免疫作用；组织转录谱分析显示：在鲤鱼鳃、肾、脾脏、肌肉、脑、心、肝七个组织均有转录，嗜水气单胞菌Ahcs01菌株刺激鲤鱼48小时后转录不同程度增强，其中与免疫相关的组织增强明显，脾脏尤为显著，这与PA28-β 在MHCⅠ类分子介导的抗原呈递过程中具有重要作用相一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一篇文献综述

综述一鱼类细胞因子研究进展

1鱼类细胞因子介绍

2细胞因子和鱼类免疫细胞的关系

3鱼类细胞因子和非特异性免疫系统的关系

4鱼类细胞因子研究成果的应用

综述二蛋白酶体激活因子PA28研究进展

1蛋白酶体结构和功能

2蛋白酶体激活因子PA28基因家族研究进展

3.蛋白酶体激活因子PA28在MHC Ⅰ类抗原提呈中的作用

4.PA28与一些疾病的关系

第二篇研究内容

实验一鲤鱼PA28-β亚单位核酸探针质粒的提取

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验二鲤鱼PA28-β亚单位cDNA克隆及序列分析

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验三鲤鱼PA28-β单位基因时空转录分析

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

致谢

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