甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎的相关miRNA的筛选与功能分析

摘要

流行性感冒是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道疾病,具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点。大量研究表明,流感病毒介导的肺部炎性损伤是引起死亡的重要原因,对严重病例的病理研究和动物实验确认后发现2009年甲型H1N1流感病毒具有直接导致严重肺炎的能力。以往研究发现,流感病毒介导肺部炎症的严重程度与宿主补体激活和病毒诱导的“细胞因子风暴”密切相关,miRNA在肺炎的发生发展过程中可能起着重要的调控作用,但目前流感病毒所致肺炎的免疫机制并不清楚,尤其是miRNA在该过程中的调控作用尚未见深入研究。为此,我们利用两株甲型H1N1流感病毒分别建立小鼠动物模型,通过miRNA芯片和mRNA芯片,深入探讨宿主miRNA在流感病毒介导肺部免疫炎性损伤中的调控机制,为进一步揭示流感病毒的致病机制奠定基础。
　　首先,我们利用甲型H1N1流感毒株A/Beijing/501/2009(H1N1)(简称BJ501)与A/PuertoRico/8/1934(H1N1)(简称PR8)建立小鼠流感病毒肺炎模型。通过对体征的观察及体重、肺指数、病理、细胞因子、补体分子、粘附分子的检测,发现模型均符合流感样症状,体重在第7天降到最低,肺指数PR8组在第7d、BJ501组在第9天达到峰值,病理出现明显肺炎表现,炎症介质表达也明显上调。两组对比发现PR8组体重降低程度、肺指数升高程度、组织病变程度及C3aR、IL6、VCAM-1、IFN-γ、TNF-α在第5天的表达程度,都显著高于BJ501组。结果表明,我们成功建立了这两种流感毒株的小鼠肺炎模型,且PR8毒株导致的肺部炎症损伤程度要略重于BJ501毒株。
　　然后我们利用miRNA芯片分别检测了小鼠感染流感病毒后第2天(早期,n=3)和第5天(中期,n=3)肺组织中miRNA的表达变化情况。与PBS组相比的结果发现:在第2天PR8组有10个miRNA表达上调,没有表达下调的,在第5天时有36个miRNA表达上调、6个表达下调;BJ501组第2天有4个miRNA表达上调、2个miRNA表达下调,在第5天有22个miRNA表达上调、3个表达下调。两模型组第2天、第5天分别与PBS组对比及组内对比结果发现在PR8组发生特异变化的miRNA有46个,在BJ501组发生特异变化的有40个,其中有30个miRNA在PR8组和BJ501组均发生显著变化,这其中28个上调,2个下调,主要包括miR-155、miR-130b、miR-21、miR-2137、miR-1949、miR-468、miR-574-3p、miR-145、miR-24-2*等;以往的研究证明,miR-155、miR-468、miR-145、miR-24-2参与了免疫调控并在炎症反应过程中发挥作用。其中miR-468在相同时间点PR8组都高表达于BJ501组,提示miR-468可能是在相同时间点PR8组炎症反应都强于BJ501的一个重要原因。
　　我们的结果表明miRNA数量及表达情况随着小鼠肺炎症程度的增加均发生差异变化,不同的毒株引起的miRNA变化的情况也不相同。该结果再次证明了宿主miRNA的表达变化参与了流感病毒介导的肺部炎症的免疫损伤。
　　同样,我们对小鼠感染流感病毒后第2天(早期,n=3)和第5天(中期,n=3)肺组织中mRNA表达谱的变化情况进行了检测。在流感病毒感染后的第2天,PR8组有106个基因表达上调,120个基因表达下调,BJ501组有216个基因表达上调,19个基因表达下调;在感染后的第5天,PR8组有1439个基因表达上调、560个基因表达下调,BJ501组有1177个基因表达上调、553个基因表达下调。进一步分析发现,感染病毒后,肺组织中细胞因子、补体分子及粘附分子如:IL6、CXCL11、CXCL10、TNF、IFN、C3aR、C5aR、CD62P、VCAM-1等均发生了显著变化,该结果与我们动物模型建立过程中对IL6、TNF-α、IFN-γ、C3aR、C5aR、CD62P、VCAM-1的定量PCR结果相一致。同时我们通过Western-blot的方法在蛋白水平对CD62P和C4两个基因进行了验证,与芯片结果完全一致。该结果表明不同病毒株之间、随着炎症程度的增加,宿主mRNA的表达谱发生了显著的变化,细胞因子、补体及粘附分子均参与了流感介导的肺部免疫损伤。
　　通过Pathway和GO分析发现,肺组织中发生显著变化的基因主要参与了细胞生理过程、调控细胞代谢、免疫进程等方面。在炎症调控过程中主要参与细胞因子与细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokinereceptorinteraction)、补体与凝血级联(Complementandcoagulationcascades)、JAK-STAT、MAPK、细胞凋亡(Apoptosis)等信号通路,且炎症较重的PR8组有更多的靶基因参与调控炎症相关通路。
　　利用perl代码与Sanger和TargetScan数据库,将miRNA和mRNA数据相结合,根据负调控的原则进行靶基因分析,结果发现PR8组和BJ501组分别有24个和21个miRNA在mRNA表达谱中检测到了靶基因,其中有16个为这两组共有的miRNA,他们是miR-130b、miR-132、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-145、miR-155、miR-188-5p、miR-18a、miR-21、miR-223、miR-24-2*、miR-449a、miR-468、miR-574-5p、miR-706、miR-7a。PR8组特异的miRNA是miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-142-5p、miR-20*、miR-30d、miR-680、miR-877*,BJ501组特异的miRNA是miR-125a-3p、miR-126-5p、miR-142-3p、miR-574-3p、miR-671-5p。
　　对取得关联miRNA的靶基因进行生物信息学分析,发现他们与炎症相关细胞信号通路相关。在细胞凋亡、补体与凝血级联通路中,发现部分miRNA抑制细胞信号通路,而部分miRNA激活信号通路。如miR-223、miR-130b、miR-24-2*激活细胞凋亡信号通路而miR-155抑制该通路;miR-145可以抑制补体与凝血级联通路的激活,而miR-24-2*激活此通路,miR-574-3p先抑制后激活此通路。另外,PR8组的miR-30d持续激活C1R,导致补体通路激活,却又通过激活SERPINE1抑制补体通路,还通过激活靶基因SOCS-3,负向调节IL-6。这体现了miRNA对信号通路调节的多样性和预示病毒与宿主相互作用达到平衡状态,并提示同一个miRNA在相同的信号通路中具有相反的作用。
　　在细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路中,PR8组较BJ501组更多的miRNA(miR-30d、miR-1、miR-133a、miR-133b)通过激活IL6、IL21R、TNF、CXCL11等基因,使得信号通路激活。提示miRNA的差异可能是导致PR8介导的炎症严重于BJ501的原因之一。
　　芯片结果发现BJ501组miR-574-3p在第5天激活C5aR,该结果与我们动物模型建立过程中对C5aR的定量PCR结果相一致,提示miR-574-3p的调节可能是导致BJ501组C5aR在第5天高表达于PBS组的原因之一。
　　作为各种炎症分子的上游调节者的miRNA,深入对他们在炎症反应方面的研究,必将有助于深入阐明流感病毒所致肺炎的免疫机制,而且可以为新型治疗药物的研发奠定基础。

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甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎的相关 miRNA的筛选与功能分析

前 言

1 流感病毒的特征与危害

2 2009 年甲型H1N1流感病毒可以直接导致严重肺部炎症反应

3 miRNA与肺炎研究的进展

4 病毒与宿主miRNA研究进展

5 甲型H1N1流感病毒与宿主miRNA研究进展

6 miRNA与炎症相关信号通路

7 本论文研究目的与意义

第一章 两种甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎模型的建立与炎症比较

实验1 甲型H1N1流感病毒的培养

实验2 PR8与BJ501介导的小鼠肺炎模型的建立与炎症比较

第二章 甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎的相关miRNA的筛选与功能分析

实验1 Agilent芯片检测甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎模型miRNA表达谱

实验2 Affymetrix芯片检测甲型H1N1流感病毒介导小鼠肺炎模型mRNA表达谱

实验3 Wester-blot检测肺组织中沉积的C4d及CD62P表达水平变化

实验4 miRNA与mRNA表达谱差异基因的关联及功能分析

结 论

参考文献

综 述

参考文献

个人简历

致谢