一种新的肝再生刺激因子--HPPCn的克隆表达、分离纯化及其生物学活性的研究

摘要

高等哺乳动物组织再生的能力非常有限，而哺乳动物的肝脏却具有非常强大的再生能力，一般情况下，人的肝脏在受损后3天之内启动肝再生，2-3周后肝脏功能基本恢复，3-6个月后肝脏大小可恢复到与受损前一样。肝脏损伤及其再生的分子生物学机制一直是人们研究的热点课题之一。我国是一个肝病大国，肝炎、肝硬化与肝癌在我国发病率高、危害严重，患病人数在1．2亿左右，因而深入研究肝细胞损伤与再生的分子生物学机制，开发治疗肝损伤的药物，具有十分重要的社会意义。 有关肝再生调控的研究已有70多年的历史，1931年Higgins等首先全面描述了大鼠部分肝切除后的再生过程，1975年LeBrecque等首次证实在哺乳期的肝脏或肝部分切除的肝脏中，存在一种特异性刺激肝细胞DNA合成的物质，命名为HSS。近30年来，国内外学者围绕肝再生的机制，对动物源及人源的HSS作了大量深入的研究。我们实验室从上世纪80年代开始致力于肝刺激物的分离纯化研究，获得了一种对CCl4引起的肝损伤具治疗作用的组分，命名为人肝细胞生成素(HPO)，并于1995年获得美国专利。最近，本室崔春萍博士等从新生小牛肝脏中分离得到了三个具有体外促进肝癌细胞增殖的蛋白质，Q-TOF质谱测序鉴定出其中之一是一个富亮氨酸的酸性核蛋白(LANP)，其同源的人源体是pp32。pp32是一个多功能的酸性核蛋白，在正常组织可自我更新的细胞和肿瘤组织中都有较高水平的表达。研究发现其在细胞的信号转导、转录调控、细胞骨架动力学以及形态发生等过程中都参与作用，但体外促进肝细胞增殖方面目前没有报道。 本研究为进一步验证该蛋白的促增殖活性并对其作用机理作更加深入的研究，需要在体外获得大量高纯度的活性蛋白。首先分别从人胎肝cDNA文库和HL-60细胞中扩增该基因，测序结果显示由HL-60细胞获得的基因与文献报道的pp32完全一致，从cDNA文库中调取的核苷酸序列与pp32不完全一致，而与genebank中pp32的一个同源基因(序列号：XM496065)相同，与pp32基因同源性达92％，蛋白同源性达94％，在此将该基因编码的蛋白命名为HPPCn。为了使人源基因HPPCn在原核表达工程菌中获得高效表达，用大引物PCR的方法将HPPCn序列中不易于原核表达的位点进行定点诱变，并将诱变后的HPPCn基因构建到原核表达载体pET-24a-d(+)中，通过引物的变动分别获得重组质粒pET-24a-d(+)-HPPCn-His+和pET-24a-d(+)．HPPCn-His-质粒，然后转化表达工程菌，EcoliBL21(DE3)的感受态细胞。利用该工程菌，先后在摇瓶和发酵罐条件下诱导表达重组蛋白。获得的菌体总蛋白，利用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等手段进行纯化，得到的纯品蛋白经HPLC检测纯度达到94．2％。对重组蛋白进行活性测定，发现所得重组HPPCn蛋白能够明显促进SMMC7721肝细胞的增殖，使其DNA合成显著提高，另外发现HPPCn对细胞迁移也表现出一定的促进作用。此外，建立了小鼠部分肝切除模型，借以检测重组HPPCn蛋白的体内活性。结果表明，HPPCn在体内促进肝损伤再生方面表现出非常显著的作用。

目录

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缩略词表

前 言

第一部分人胎肝源LANP蛋白即HPPCn的克隆及表达载体的构建

第二部分重组HPPCn工程菌的发酵、分离纯化

第三部分原核表达HPPCn的生物学活性鉴定

讨 论

总 结

参考文献

文献综述富含亮氨酸的酸性核蛋白家族研究进展

致 谢

硕士期间发表的论文