大肠杆菌细胞中不依赖PTS系统的葡萄糖转运途径的构建与优化

摘要

葡萄糖是工业生产中应用最广泛的碳源，其代谢水平会显著影响工业生产的成本和效率。在大肠杆菌中葡萄糖首先经过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(PTS系统)进入细胞质内，每转移一分子的葡萄糖需要消耗一分子的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。然而PEP是许多工业化合物的重要前体物质，如丁二酸，苹果酸，芳香族化合物。为了提高这些化合物的产量，通常需要失活PTS系统来提高PEP的供给，从而提高目标产物的代谢流量。
　　虽然上述方法可以提高PEP的供给，但是所获得的PTS-菌株的葡萄糖转运能力都很低。为了提高PTS-菌的葡萄糖转运能力，本研究引入了来自大肠杆菌和运动发酵假单胞菌（Zymomonasmobilis）的两种转运蛋白GalP(Escherichiacoli),Glf(Z.mobilis)和两种葡萄糖激酶(Glk)。并利用不同强度的人工调控元件调控了两蛋白的表达，构建了三种不依赖PTS系统的葡萄转运途径。研究发现Glf的转运能力要优于GalP，原因是因为Glf转运不需要任何形式的能量和高速转运葡萄糖的能力。而GlkZ.mobilis酶的活性虽然比GlkE.coli的高，但是葡萄糖转运速率降低(0.58g/L·h)，可能跟假单胞菌Glk受胞内能量供给状态的紧密调控有关。所得到的最优菌株JT014(Glf12，GlkE.coli12)葡萄糖利用速率为2.13g/L·h，比野生菌ATCCC8739提高了81％，比JL043(GalP93，GlkE.coli37)的葡萄糖利用速率提高了30％。
　　同时还将该葡萄糖转运途径用于丁二酸的生产。研究发现调控galP，glkE.coli得到最优的菌株NZ061丁二酸产量提高20％，而调控glf,glkE.coli获得的最优菌株JL052丁二酸产量提高41％。本研究表明组合调控Z.mobilis的glf和E.coli的glk基因，可以有效提高PTS-菌株的葡萄利用能力和丁二酸生产能力，同时可用于其他以PEP为前体的化合物的生产。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大肠杆菌中葡萄糖的运输途径

1．1．1 葡萄糖由胞外运输到周质间歇(periplasm)

1．1．2 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶(PTS)系统

1．1．3 GalP和Glk组成的葡萄糖转运系统

1．1．4 Mgl和Glk组成的葡萄糖转运系统

1．2 通过改造葡萄糖运输途径作用到丁二酸生产的研究现状

1．3 基因表达调控策略

1．4 研究目的意义及研究内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 主要内容

2 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 人工调控元件文库

2．1．3 引物

2．1．4 培养基

2．1．5 主要的仪器设备和化学试剂

2．1．6 主要溶剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌株培养和发酵

2．2．2 分析检测方法

2．2．3 菌株的遗传改造

2．2．4 用于基因整合敲除质粒的构建

2．2．5 不同葡萄糖转运途径的构建

2．2．6 将不依赖PTS系统的葡糖转运途径应用于丁二酸的生产

3 结果与讨论

3．1 用于基因整合敲除质粒的构建

3．2 GalP和GlkE．coli组成的葡萄糖转运途径

3．3 Glf和GlkE．coli瑚组成的葡萄糖转运途径

3．4 Glf和GlkZ．mobilis洒组成的葡萄糖转运途径

3．5 将不依赖PTS系统的葡萄糖转运途径应用于丁二酸的生产

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢