顺铂前药用于肝细胞癌靶向治疗的研究

摘要

目的:
　　肝细胞癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，化学治疗在肝细胞癌的治疗中发挥着重要的作用，尤其是中晚期患者的治疗。顺铂是临床上常用的广谱化疗药物，但由于其半衰期短、水溶性差、毒性大而限制了其在临床上的广泛应用。为了克服以上缺点，本研究设计了一种基于普鲁兰多糖的顺铂前药，以期用于对肝细胞癌的靶向治疗。
　　本论文的研究内容分为三部分。第一部分为顺铂-琥珀酰基普鲁兰多糖高分子前药CDDP-SUPA的制备及表征。第二部分为CDDP-SUPA的体外研究，包括释药特性、细胞毒性、与DNA的相互作用、对细胞凋亡及细胞周期的影响。第三部分为CDDP-SUPA的体内研究，包括在正常小鼠体内的急性毒性、在肝细胞癌荷瘤小鼠体内的组织分布情况及其抗肿瘤的活性。
　　方法:
　　1.制备与表征：通过两步酯化反应合成高分子前药CDDP-SUPA。首先，将普鲁兰多糖与琥珀酸苷反应生成琥珀酰基普鲁兰多糖（SUPA），再将顺铂（CDDP）通过酯键偶联于SUPA，即得 CDDP-SUPA；利用IR和1H NMR对CDDP-SUPA的化学结构进行确证；采用pH滴定法检测SUPA中琥珀酰基取代度；采用原子吸收分光光度法测定CDDP-SUPA分子中CDDP的含量。
　　2.体外实验：采用动态透析法考察CDDP-SUPA的体外释药特性。利用CCK8试剂盒检测CDDP-SUPA对肝细胞癌HepG2的毒性；将CDDP-SUPA与基因组DNA共孵育，采用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增报告基因，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，考察CDDP-SUPA对DNA复制的影响；通过流式细胞术分析CDDP-SUPA对HepG2细胞凋亡的诱导作用，并利用细胞周期试剂盒分析CDDP-SUPA对其细胞周期的影响。
　　3.动物体内实验：考察CDDP-SUPA对正常小鼠的急性毒性，并通过HE染色法分析 CDDP-SUPA对肝、肾组织病理学变化的影响。构建肝细胞癌MHCC-97H裸鼠移植瘤模型，通过小动物活体成像技术分析荧光标记的
　　CDDP-SUPA-Cy5.5在荷瘤小鼠体内的组织分布情况；采用尾静脉注射给药的方式，评价CDDP-SUPA在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用，并通过HE染色法分析CDDP-SUPA对肿瘤组织病理学改变的影响。
　　结果:
　　1.合成了顺铂高分子前药CDDP-SUPA，其分子中琥珀酰基的取代度为38.2％，CDDP的含量为18.7%。
　　2.与游离CDDP相比，CDDP-SUPA在pH7.4的PBS缓冲液及含10%人血清pH7.4的PBS缓冲液（PBS/10%HS）中，均显著延缓了CDDP的释放。
　　3.和对肺癌A549细胞的作用相比，CDDP-SUPA对肝细胞癌HepG2细胞的生长具有更强的抑制作用；CDDP-SUPA显著地抑制了基因组DNA的复制，且抑制作用呈现明显的浓度依赖性；CDDP-SUPA能够显著诱导HepG2细胞凋亡，并导致细胞周期的S期阻滞。
　　4.和游离CDDP相比，CDDP-SUPA在15μmol/kg和30μmol/kg CDDP的给药剂量下显著延长了Babl/c小鼠的生存期，并且未发现其造成小鼠肝肾的组织病理学变化。
　　5.尾静脉给药24 h后，CDDP-SUPA主要分布于MHCC-97H荷瘤小鼠的肝脏与肿瘤组织中；和游离CDDP相比，CDDP-SUPA在3.5μmol/kg和7.0μmol/kg的给药剂量下表现出对肿瘤生长更强的抑制作用。
　　结论:
　　本研究成功合成了基于普鲁兰多糖的高分子前药CDDP-SUPA，具有较高的载药量；CDDP-SUPA表现出对肝细胞癌较高的体外选择性，能够有效地抑制HepG2细胞的体外生长；和游离药物相比，CDDP-SUPA表现出更低的毒性，显著延长了小鼠的生存时间；尾静脉注射给药后，CDDP-SUPA主要分布于肝细胞癌MHCC-97H荷瘤小鼠的肝脏和肿瘤组织，并能够显著抑制肿瘤的体内生长。因此，本研究合成的CDDP-SUPA是一种性质优良的高分子前药，有望用于肝细胞癌的靶向治疗。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、高分子前药CDDP-SUPA的制备及表征

1.1对象和方法

1.1.1材料与仪器

1.1.2实验方法

1.1.3统计学分析

1.2结果

1.2.1高分子前药CDDP-SUPA的结构确证

1.2.2 SUPA中琥珀酰基基团DS的测定

1.2.3 CDDP-SUPA中CDDP含量的测定

1.3讨论

1.3.1 高分子前药CDDP-SUPA的制备

1.3.2 CDDP-SUPA中CDDP含量的测定

1.4小结

二、高分子前药CDDP-SUPA的体外实验

2.1对象和方法

2.1.1材料与仪器

2.1.2基本实验技术

2.1.3实验方法

2.1.4统计学分析

2.2结果

2.2.1 CDDP-SUPA中CDDP释放的体外考察

2.2.2 CDDP-SUPA的体外细胞毒性评价

2.2.3 CDDP-SUPA对DNA复制的阻滞作用

2.2.4细胞凋亡分析

2.2.5细胞周期分析

2.3讨论

2.3.1 CDDP-SUPA中CDDP释放的体外考察

2.3.2 CDDP-SUPA的体外细胞毒性评价

2.3.3 CDDP-SUPA对DNA复制的阻滞作用

2.3.4细胞凋亡与周期分析

2.4小结

三、高分子前药CDDP-SUPA的体内实验

3.1对象和方法

3.1.1材料与仪器

3.1.2基本实验技术

3.1.3实验方法

3.1.4统计学分析

3.2结果

3.2.1 CDDP-SUPA对小鼠的急性毒性实验

3.2.2 CDDP-SUPA的体内抗肿瘤活性的研究

3.2.3 CDDP-SUPA在荷瘤鼠体内的组织分布

3.3讨论

3.4小结

全文结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:抗肿瘤药物传递系统的研究进展

致谢