siRNA介导的雄激素受体抑制及其在肝癌细胞株细胞凋亡中的作用

摘要

目的：AR在HCC的发病和发展中起着重要作用。AR可调节多个靶基因的表达。尚不清楚AR是否可以调节PEGl0和Caspase-12的表达。RNAi通过启动RNA双链，特异性地降解相应序列的靶mRNA而引起的同源基因表达沉默。在此，我们先在肝癌细胞株探讨化学合成的siRNA双链对AR的抑制作用，再探讨AR对PEG 10和Caspase-12表达的调控作用，最后进一步探讨RNAi介导的AR抑制在HepG2细胞凋亡中的作用。 方法：设计靶向人AR的siRNAs(AR siRNAs-943，AR siRNAs-2125.ARsiRNAs-2859)。以靶向SARS-CoY基因的双链siRNA作为阴性对照。化学合成结尾为TT的2l nt RNA，并行退火处理。用含10％胎牛血清高糖DMEM培养HepG2和7404细胞。用脂质体转染siRNAs进入细胞。通过用胎盘蓝染色计数从培养板中去除的细胞检测细胞活力。用TRIZOL试剂抽提总RNA，并用RT-PCR检测mRNA水平。抽提总蛋白，用western blot检测AR。构建人PEGlO表达质粒，并在大肠杆菌中表达。纯化蛋白。制备兔源性抗PEGl0多克隆抗体。用5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡，用流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果：(一)3对AR siRNAs双链体中，siRNAs-2859双链体在mRNA和蛋白水平同时特异地抑制AR基因的表达，浓度为240nM时抑制作用最大，达80％以上。siRNAs-2859双链体可特异地剂量依赖地降低7404细胞AR基因的表达。浓度为240 nM AR siRNAs-2859转染HepG2和7404细胞后，AR siRNAs-2859抑制作用可持续72h以上。AR siRNAs-2859和对照siRNAs处理培养液活细胞和死细胞总数无显著差异，表明所得的AR基因表达下调不是AR siRNAs-2859双链体的毒性作用所致。 (二)不同浓度的双链siRNA转染HepG2和H7404细胞，可特异地以剂量依赖的方式降低HepG2和7404细胞AR表达水平。HepG2～17404细胞中，PEG 10和Caspase-12表达抑制亦存在剂量依赖性。用浓度为240nM的ARsiRNAs-2859转染HepG2和7404细胞，24h，48h，和72h后PEG10和Caspase-12表达水平抑制作用达80％以上，且持续72h。24h后可见ARsiRNAs-2859介导的PEG10和Caspase-12表达抑制，48h后抑制作用达到最大，72h后开始减弱。雄激素可促进HepG2细胞PEGlO和Caspase-12的表达，但对AR表达未见明显作用。 (三)用不同浓度的双链siRNA转染HepG2细胞。24h后用5-Fu处理细胞，12h后AR抑制的HepG2细胞凋亡明显增加，且与双链siRNA浓度存在剂量依赖性。用浓度为240 nM的AR siRNAs-2859转染HepG2细胞，24h后用5-Fu处理细胞，AR抑制的HepG2细胞48h内无明显变化。 结论：化学合成的slRNAs 能以剂量依赖地的方式有效地序列特异性地抑制AR基因的表达。我们筛选到1对siRNA，它能在浓度为240nM时序列特异地降低HepG2和7404细胞靶基因表达达80％以上。AR作为转录因子参与了肝癌细胞株HepG2和7404细胞PEGl0和Caspase一12表达的调控。这些可能是HCC男性发病较高的原因。下调肝癌细胞AR蛋白水平可促进细胞凋亡，由此引起的细胞凋亡可能与下调PEGl0和Caspase-12水平有关。

目录

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摘要

引言

第一章化学合成的siRNAs对人肝癌细胞株雄激素受体抑制作用

第二章雄激素和雄激素受体对肝癌细胞株PEG10表达的作用

第三章siRNA介导的雄激素受体抑制对肝癌细胞株细胞凋亡作用

参考文献

致谢

雄激素受体结构和功能研究进展

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