荧光原位杂交技术在生殖遗传中的应用研究——体外异常受精检测、胚胎植入前诊断、嵌合型核型检测及精子检测

摘要

第一部分体外受精后三原核受精卵的性染色体分析 目的：对体外受精周期(IVF和ICSI)中产生三原核受精卵运用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH)进行性染色体非整倍体率检测，分析其原核来源。通过对三原核受精卵的遗传学检测研究，探讨在病人促排卵周期中卵子少情况下或3PN卵占受精卵大多数的情况下，3PN卵发育成的胚胎是否有移植价值。 方法：应用FITC、Texas red标记的X／Y染色体着丝粒部位α卫星重复序列探针对体外受精(in vitro fertilization，IVF)和单精子显微注射(intracytoplas-mic sperm injection，ICSI)周期中三原核受精卵(tripronuclear zygotes，3PN)进行荧光原位杂交并对各种性染色体核型统计学分析。 结果：收集体外受精后三原核卵子90个，其中常规IVF后49个，ICSI后三原核卵子41个，固定后分别剩余36个和32个，行x／Y双色探针荧光原位杂交，有杂交信号的分别为26个和24个。总固定率为75.56％，杂交率为73.53％。共分析有杂交信号的3PN受精卵50个，IVF后3PN受精卵的性染色体三体率为92.31％，二体率为3.85％，单体率为3.85％；共存在3种性染色体三体核型：XXX、XXY、XYY。ICSI后3PN受精卵性染色体的三体率为70.83％，二体率为25％，单体率为4.17％；共存在2种性染色体三体核型：XXX、XXY。 结论：IVF后3PN受精卵中多余的原核多为精子来源，其胚胎没有移植价值；ICSI后3PN中多余的原核为非精子来源，而很可能来自于第二极体。ICSI后的3PN受精卵与IVF相比有显著增高的性染色体二体率。 意义：我们用荧光原位杂交的方法进行了IVF和ICSI后三原核受精卵(3PN)性染色体核型的研究，对多原核异常受精卵的原核来源和移植价值进行了初步的探讨，为多原核受精卵的发生机制及发生几率的进一步研究提供了初步的基础，在国内没有其他报道。 第二部分 目的：分析常规体外受精和单精子显微注射周期中来源于单原核受精卵发育来的胚胎性染色体的倍性，探讨其原核来源和移植价值。 方法：应用FITc、Texas red标记的x／Y染色体着丝粒部位α卫星重复序列探针对常规体外受精和单精子显微注射周期中来源于单原核受精卵的胚胎行荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)，对结果进行统计学处理，分析其性染色体的倍性和性染色体类型。 结果：共分析来自常规体外受精(IVF)和单精子显微注射(ICSI)周期中来源于单原核受精卵的胚胎111个。总胚胎固定率为92.80％，胚胎杂交率为95.15％。有杂交信号的常规体外受精后单原核受精卵发育来的胚胎中，胚胎性染色体二体率为54.35％，单体率为23.91％，嵌合体率为21.74％。有杂交信号的单精子显微注射后单原核受精卵发育来的胚胎中，胚胎性染色体二体率为34.62％，单体率为34.62％，嵌合体率为30.77％。 结论：常规体外受精和单精子显微注射周期中来源于单原核受精卵的胚胎有高于正常的性染色体异常率(非二体)，不适合进行胚胎移植；但前者性染色体二体率显著高于后者，证明IVF过程中的1PN来源胚胎部分为正常受精胚胎。在性染色体单体的lPN来源胚胎中以XO为主要核型，并显著高于YO，证明单原核发育来的单倍体胚胎多数为孤雌来源。 意义：单原核受精卵不同于多原核受精卵，在胚胎培养过程中，单原核的受精卵通常会与其他双原核受精卵一样，培养成为胚胎甚至进行胚胎移植，通常的实验室可能会将单原核理解成原核过早融合。所以我们收集了单原核形成的胚胎而不是受精卵进行分析，通过本实验我们也分析了单原核受精卵发育来的胚胎其性染色体二体的比例以及各种性染色体核型类型的比例，为临床工作提供了参考，也为进一步探讨单原核形成机制和来源提供了基础。 第三部分 目的：运用荧光原位杂交技术(FISH)对生育过21三体患儿的高育龄妇女的胚胎进行植入前遗传学诊断，以达到优生目的。 方法：应用FITC标记的21号染色体探针对生育过21三体患儿的高育龄妇女的胚胎活检后进行单个卵裂球遗传学检测，选择正常核型胚胎进行移植。 结果：常规单精子显微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperminj ection，ICSI)后获取胚胎4个，活检优质胚胎3个，杂交后每个卵裂球均出现3个21号染色体完整信号，认为3个胚胎均为21三体异常胚胎，故建议放弃移植，从而成功避免了21三体患儿的出生。 结论：运用21号染色体探针荧光原位杂交技术对生育过21三体患儿的高育龄妇女的胚胎进行植入前遗传学诊断是可行的，同时也是必要的，是避免非整倍体患儿出生的重要途径。 意义：对高育龄妇女尤其是生育过21三体患儿的妇女进行PGD筛查是目前世界范围内PGD开展的主要内容，对提高人口素质，减少患儿出生具有重要意义，本研究成功避免了异常胚胎的种植，提示该项筛查是可行和必要的。 第四部分全染色体探针进行罗伯逊易位携带者胚胎植入前诊断 目的：运用全染色体探针荧光原位杂交技术(fluorescent in situhybridization，FISH)对14／21罗伯逊易位携带者体外受精的胚胎进行植入前遗传学诊断，达到优生目的。 方法：应用FITC、Texas red标记的14／21全染色体探针对14／21罗伯逊易位携带者的胚胎活检后的单个卵裂球进行遗传学检测，选择正常核型胚胎进行移植。 结果：常规单精子显微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)后获取胚胎12个，活检优质胚胎11个，杂交后有信号胚胎7个，其中1个正常胚胎，1个携带者胚胎；1个14单体胚胎，1个2l单体胚胎，1个21三体胚胎，另2个胚胎活检后均为21号染色体二体，无14号染色体信号。 结论：运用14／21全染色体探针荧光原位杂交技术对14／21罗伯逊易位携带者的胚胎进行植入前遗传学诊断是能够将正常核型胚胎挑选出来进行移植，并筛查出异常胚胎和携带者胚胎，从而达到优生目的。 意义：为罗伯逊易位等染色体结构异常的患者提供了一种可以避免患儿出生的诊断方法。同时减轻了女方痛苦，避免了因怀上异常胚胎或携带者胚胎需要人工流产带来的身心上的伤害。 第五部分 目的：对细胞遗传学检测诊断为染色体嵌合型的病例运用荧光原位杂交技术进行目标染色体确认诊断。 方法：常规G带显色分析后疑似为性染色体嵌合体核型的病例，通过荧光原位杂交，应用FITC、Texas red标记的x／Y染色体着丝粒部位Q卫星重复序列探针进行检测，以确定嵌合染色体各型所占比例。 结果：G带染色核型分析诊断为45，x／47，XXX的患者，G带显色后共计数完整分裂相110个，45，x和47，xxx分别占78.18％和21.82％；荧光原位杂交后进行性染色体核型统计，共计数有杂交信号的细胞和分裂相700个，X和XXX分别占75.86％和24.14％；两种计数结果相比无统计学差异。 结论：荧光原位杂交对于嵌合体核型检测在准确诊断的基础上能够较常规核型分析观察更多的分裂相，还可以分析核膜完整染色体未分散的间期细胞，计数更多的细胞数，减少了占少数核型的嵌合型染色体的漏诊，并大大节省了分析时间，为临床提供更准确的数据。 意义：在常规G带显色的细胞遗传学基础上，诊断更确切。对于嵌合型的诊断能够提供一种切实可行且省时省力的补充诊断方法，能更清楚的反映患者实际的嵌合体各型比例。

目录

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符号说明

前 言

论文Ⅰ体外受精周期中异常受精卵子和胚胎性染色体分析

论文Ⅱ运用FISH行胚胎植入前遗传学诊断的临床应用

论文Ⅲ运用荧光原位杂交对染色体嵌合型进行诊断的研究

论文Ⅳ荧光原位杂交检测精子上游时间对XY精子比例的影响

参考文献

致 谢

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