中国不同地区A、B组轮状病毒分离株VP7基因序列的比较分析

摘要

目的： 研究从我国大庆地区婴幼儿腹泻临床粪便标本中分离的一株A组人轮状病毒阳性毒株(命名为DQ-1株)VP7基因的基因分型，对DQ-1株VP7基因序列和糖蛋白VP7的蛋白质结构进行分析，并与已测序同血清型标准株和国内外地方株VP7基因序列进行序列比对。 方法： 通过RT-PCR技术扩增人A组轮状病毒DQ-1株VP7全长基因，并将RT-PCR)产物连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养，形成单菌落后挑取白色菌落进行检测，从中筛选出两个PCR阳性菌落，并提取质粒，双酶切鉴定，最后利用通用引物进行测序。利用DNAStar软件对DQ-1株VP7基因测序序列与其他A组轮状病毒株VP7基因序列进行同源性比较；用RNAstructure4.4软件绘制DQ-1株VP7基因的二级结构；用Predictprotein软件对DQ-1株糖蛋白VP7蛋白结构进行分析。 结果： DQ-1株VP7基因与同型的我国已测序G1型地方株T73、R96-197株基因序列同源性均为97.6﹪，与G1型标准株Wa株核苷酸序列同源性为92.9﹪，与G2血清型代表株DS-1株基因序列同源性为73.8﹪，与G3血清型代表株SA11株核甘酸序列同源性为75.6﹪，与G4血清型代表株J-4621株(78.1﹪)同源性也不高；其VP7基因mRNA可折叠多达20个发卡结构。DQ-1株VP7蛋白是由354个氨基酸组成的多肽，含有2个潜在的糖基化位点和多个磷酰化位点；DQ-1株氨基酸序列与T73、R96-197株同源性都达97.5﹪，与wa株达94.6﹪，而与其它型DS-1株、SAll株和J-4621株分别仅为74.4﹪、79.4﹪和75.2﹪。因此，我们推定DQ-1株属于Gl血清型。 结论： DQ-1株VP7基因序列与已测序我国G1型地方株VP7基因序列几乎没有差别，而与Gl型标准株VP7基因序列存在细微差异，这为我国人A组轮状病毒疫苗的引进和研制提供了分子生物学依据。 目的： 克隆中国不同地区四个B组成人腹泻轮状病毒株结构蛋白VP7基因，通过测序得到其核苷酸序列和氨基酸序列，比较与其它B组轮状病毒毒株基因和氨基酸序列同源性，从而进一步分析我国不同地区流行的B组成人腹泻轮状病毒毒株之间的系统进化关系。 方法： 参照文献设计引物，对中国不同地区流行的4株B组轮状病毒株进行RT-PCR，并将RT-PCR产物克隆到PCR Ⅱ载体，转化E．Coli感受态细胞，提取转化菌质粒经限制性内切酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切分析，从中筛选阳性重组质粒进行测序，测序结果采用DNAStar6.0进行多重序列比对分析，并与B组轮状病毒代表株和其它已测序地方株的核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较，绘制系统遗传进化树。 结果： 本研究获得的4株B组成人腹泻轮状病毒株核苷酸序列同源性为97.3﹪～98.8﹪，氨基酸序列同源性为95.2﹪～99.3﹪之间；与B组成人腹泻轮状病毒代表株ADRV核苷酸序列同源性为98.2﹪～100﹪，氨基酸序列同源性为97.4﹪～100﹪；与国外B组成人腹泻轮状病毒株印度、孟加拉国株核苷酸序列同源性为90.1﹪～92.5﹪，氨基酸序列同源性为92．3﹪～95．6﹪。 结论： 研究表明所有B组成人腹泻轮状病毒毒株均属于同一血清型，这为成人腹泻轮状病毒的流行病学监测以及将来研制成人腹泻轮状病毒疫苗提供了分子生物学依据，同时本研究可以从分子病毒学理论上证明“病毒是以居群的形式存在的”和“病毒的居群内部存在一个’差异谱’”的说法。

目录

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符号说明

论文第一部分：大庆地区A组人轮状病毒DQ-1株VP7基因序列和蛋白质结构分析

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

论文第二部分：中国不同地区B组人腹泻轮状病毒分离株VP7基因序列的比较分析

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

文献综述 轮状病毒疫苗的最新研究进展

研究结论与创新之处

附图

致谢

攻读硕士学位期间已发表或待发表论文情况：