利用代谢工程构建D-甘露醇生产菌株

摘要

D-甘露醇(D-Mannitol)作为一种功能性糖醇，广泛应用于医药工业、食品工业及化学工业等领域。近年来，利用重组微生物合成D-甘露醇的方法因其更加安全、环境友好及较高的特异性越来越受到重视。大肠杆菌(Escherichia coli)拥有最成熟的基因操作方法，并已被普遍接受作为生产生物基化学品的优秀平台，因此可以作为生物合成D-甘露醇的优良宿主。
　　本研究从野生型大肠杆菌ATCC8739出发，将来自假肠膜明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides ATCC12291菌株的D-甘露醇脱氢酶基因与果糖转运蛋白基因整合到大肠杆菌ATCC8739的染色体中，并失活其他的发酵途径，构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株Mtl-002，D-甘露醇的产量达到1.15 mmol/L。在该菌株中失活大肠杆菌的磷酸酶转移系统，并使用半乳糖透性酶(Galactose permease，GalP)和果糖转运蛋白(fructose transporter，FupL)进行葡萄糖和果糖的转运，获得的菌株Mtl-003使用无机盐培养基，以葡萄糖果糖作为混合碳源厌氧发酵6天，D-甘露醇的产量达到1.21 mmol/L。基于菌株Mtl-003中细胞生长和D-甘露醇合成的偶联，进一步通过代谢进化技术提高细胞合成D-甘露醇的生产能力。经过80代的驯化后得到的菌株Mtl-004，D-甘露醇产量达到4.4 mmol/L，D-甘露醇脱氢酶的酶活为0.38 U/mg pro，MDH的编码基因内部发生了突变D301Y(g901t)。为了进一步提高细胞对果糖的转运能力，将调控后的葡萄糖转运蛋白(Glucose facilitator，glf)基因整合到Mtl-004中获得菌株Mtl-005，其发酵产D-甘露醇的量达到6.22 mmol/L。
　　之后，为了以葡萄糖为底物直接生产D-甘露醇，将来自米苏里游动放线菌Actinoplanes missouriensis(DSM43046)中的葡萄糖异构酶(glucose isomerase，口aG1)基因整合到菌株Mtl-005中。使用不同强度的调控元件对aGI的表达强度进行调控，其中的一株菌Mtl-009，以葡萄糖为唯一碳源发酵产D-甘露醇的量最高达到6.44 mmol/L。
　　通过将D-甘露醇合成途径中的D-甘露醇脱氢酶基因，果糖转运蛋白的编码基因和葡萄糖异构酶基因整合在大肠杆菌的染色体中，本研究成功构建了一株能够稳定遗传的以葡萄糖为碳源生产D-甘露醇的菌株，D-甘露醇的最高产量为6.44 mmol/L。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 D-甘露醇概述

1．1．1 D-甘露醇的应用

1．1．2 甘露醇的市场情况

1．1．3 国内外研究历史及现状

1．2 研究目的及意义

1．3 研究内容和技术路线

1．3．1 本课题的立题依据

1．3．2 本课题研究内容

2 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物

2．1．3 培养基

2．1．4 主要的仪器设备和化学试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌株培养和发酵

2．2．2 分析方法

2．2．3 菌株的遗传改造

2．2．4 用于基因表达整合敲除质粒的构建

2．2．5 D-甘露醇代谢路径的构建

2．2．6 Mtl-002菌株中PTS系统的失活及Ppck*调控galP基因

2．2．7 Mtl-003菌株的代谢进化

2．2．8 表达外源葡萄糖异构酶基因的质粒构建

2．2．9 整合外源aGI基因质粒的构建

2．2．10 将glf基因整合至菌株的ptsI位点，并用固定强度的启动子调控

2．2．11 将aGI基因整合至菌株的mgsA位点，一步同源重组调控aGI基因

2．2．12 aGI基因一步调控后的菌株发酵

3 结果与讨论

3．1 D-甘露醇脱氢酶基因的表达

3．1．1 质粒pXZ401的构建

3．1．2 D-甘露醇脱氢酶(MDH)的酶活力测定

3．2 竞争性代谢途径的敲除

3．2．1 两步同源重组策略的构建

3．2．2 ldhA基因的敲除

3．2．3 frdBC基因的敲除

3．2．4 pflB基因的敲除

3．2．5 adhE基因的敲除

3．2．6 mgsA基因的敲除

3．2．7 poxB基因的敲除

3．3 D-甘露醇合成途径的构建

3．3．1 pXZ054质粒的构建

3．3．2 MltP-mdh-fupL基因簇在染色体DNA上的整合

3．3．3 菌株Mt1002发酵

3．4 PTS系统的失活及galP基因的表达调控

3．4．1 Mtl-002菌株中PTS系统的失活

3．4．2 galP基因的表达调控

3．4．3 Mtl-003菌株发酵

3．5 Mtl-003菌株代谢进化

3．5．1 代谢进化的基础

3．5．2 Mtl-003菌株的代谢进化

3．6 Mtl-003和Mtl-004菌株发酵

3．6．1 菌株Mtl-003、Mtl-004发酵结果

3．6．2 Mtl-003和Mtl-004菌株发酵结果分析

3．7 glf基因在染色体DNA上的整合

3．8 以葡萄糖为底物生产D-甘露醇菌株的构建

3．8．1 aGI基因的整合及表达调控

3．8．2 将aGI基因整合到菌株染色体上

3．8．3 一步同源重组的方法调控aGI基因

3．8．4 一步同源重组的方法调控aGI基因后的菌株发酵

4 结论

5 展望

参考文献

论文发表情况

致谢