苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫晶体蛋白进入根结线虫体内的模式

摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌，在芽胞形成期产生的晶体蛋白对许多昆虫有毒力，因而被广泛用作害虫的生物防治。近些年来发现其对线虫也有毒力。本文从苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的防治效果、杀线虫晶体蛋白基因表达调控和晶体蛋白对植物寄生线虫的作用方式等方面研究了苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的作用。 1.测定了苏云金芽胞杆菌YBT-1532菌株对根结线虫毒力及防治效果。该菌株携带有编码130kDa晶体蛋白的杀线虫基因cry1Ea6，同时该菌株还产生丰富的苏云金素，也对线虫有很高的毒力。分别测定该菌株产生的晶体蛋白和苏云金素对北方根结线虫(Meloidogynehapla)二期幼虫的毒力，发现它们都表现出了很高的毒力，其LC50分别为19.32μg/mL和25.87μg/mL。同时，我们还测定了在盆栽条件下该菌株对北方根结线虫的防治效果。结果显示，在盆栽条件下该菌株可以有效抑制北方根结线虫对番茄的感染、降低根组织上根结数量、产卵量以及土壤中的虫口密度。我们还进行了防治花生根结线虫(M.arenria)的田间初步实验，该菌株对花生根结线虫并没有表现出明显的防治效果，但是可以使花生增产6％左右。 2.在杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa2操纵子中发现了一个负调控因子。在cry6Aa2基因下游还有一个基因orf2，两基因之间存在一个茎环。处在两基因之间的茎环抑制orf2的表达，使之处于一个相对较低的表达水平。当突变orf2时，cry6Aa2基因表达量明显提高；当在出发菌株YBT-1518中突变orf2基因时，cry6Aa2的表达水平也显著提高；当去掉茎环结构时，orf2得到大量表达，cry6Aa2表达水平急剧降低，这预示着orf2对cry6Aa2基因的表达有负向调控作用。同时EMSA实验还表明orf2表达的蛋白质能结合到茎环上。所有实验结果表明，在克隆的操纵子当中，茎环抑制调节基因orf2的表达，而调节基因orf2表达的蛋白质结合到茎环上，这可能打开茎环，从而影响了cry6Aa2基因转录产物mRNA的稳定性，因而降低了cry6Aa2的表达，从而实现对cry6Aa2表达的负向调控。在苏云金芽胞杆菌中，存在着许多正向调节因子来提高杀虫晶体蛋白基因的表达，而像本研究中orf2这种负向调节因子还比较少见。本研究发现了一个新的晶体蛋白基因表达负向调控模式，为提高晶体蛋白表达量提供了一条新的途径。 3.初步研究了晶体蛋白进入根结线虫体内的方式。由于植物寄生线虫大多专性寄生，主要依靠其刺吸式口器-口针从植物细胞内吸取细胞内含物的方式来取食，晶体蛋白很难通过其口针直接进入体内。但是许多研究结果表明，伴胞晶体蛋白的确能够对植物寄生线虫表现出毒力，那么，苏云金芽胞杆菌晶体蛋白是如何进入植物寄生线虫体内并且发生毒力作用的呢?本文以北方根结线虫为作用对象，Westernblot检测发现溶解的晶体蛋白毒素Cry6Aa2的确可以通过某种方式进入根结线虫体内，并且与线虫体内的毒素受体结合，使得毒素分子量明显增加；而用CrySB毒素感染根结线虫，从线虫体内也能检测到该蛋白，但是发现该蛋白被降解成大约70kDa，这也表明两种典型的杀线虫晶体蛋白Cry6A和Cry5B对线虫的作用方式有差异。用对线虫无毒力的小分子量蛋白Cry51Aa1作用根结线虫时，同样能从其体内检测到该蛋白，但是分子量没有任何变化。用罗丹明标记的Cry6Aa2毒素作用根结线虫，激光共聚焦扫描显微镜观察发现，荧光信号首先出现在线虫体表，随着作用时间的延长，线虫体内才开始出现荧光，而且荧光信号从最初的弥散状态逐渐集中到其肠道组织上。在作用过程中，线虫的口针自始至终都没有荧光出现。该实验结果表明，毒素蛋白可能是通过线虫体壁进入根结线虫体内，然后作用线虫的肠道组织。本实验初步研究了晶体蛋白毒素对植物寄生线虫地作用方式，为利用苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫提供理论支持。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章 文献综述

1植物寄生线虫及其防治

1.1植物寄生线虫概述

1.2植物寄生线虫及其病害的发现

1.3植物寄生线虫的危害

1.4植物寄生线虫的防治

2苏云金芽胞杆菌及其cry基因的表达调控

2.1苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性

2.2苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因

2.3苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达与调控

2.4转录后水平的调控

2.5翻译后水平的调控

2.6影响杀虫晶体蛋白基因表达的因素

3苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的作用

3.1苏云金芽胞杆菌对线虫活性及毒力测定

3.2源自Bt的杀线虫基因及其产物

3.3 Bt对线虫作用机制

研究目的和意义

第二章苏云金芽胞杆菌YBT-1532菌株对根结线虫的防治效果

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1.YBT-1532菌株特性

2.2 YBT-1532产生的晶体蛋白和苏云金素对北方根结线虫毒力

2.3 YBT-1532在盆栽条件下对根结线虫的防治效果

3小结与讨论

附录：YBT-1532菌株对根结线虫防治效果的田间试验

第三章苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa2表达及其调控

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1苏云金芽胞杆菌YBT-1518及杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa2

2.2含有cry6Aa2基因的HindIII克隆片段的结构分析

2.3 cry6Aa2表达及其对根结线虫毒力测定

2.4 orf2基因表达及茎环结构对其抑制作用

2.5 off2对cry6Aa2表达的负调控作用

2.6 orf2对cry6Aa2表达的负向调节作用方式

3小结与讨论

第四章苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫作用机制研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1苏云金芽胞杆菌晶体蛋白毒素的制备与纯化

2.2 Western blot检测晶体蛋白毒素进入根结线虫体内

2.3 HITC标记的晶体蛋白Cry6Aa2作用根结线虫

2.4罗丹明标记晶体蛋白Cry6Aa2效果

2.5荧光标记蛋白毒素作用线虫

2.6双向电泳分离鉴定线虫体内的毒素蛋白受体

3小结与讨论

参考文献

致谢

发表论文附录