检测狐狸微孢子虫病胶体金试纸条的制备

摘要

微孢子虫（Microsporidia）是一类属于微孢子虫目的真核微生物，能引发宿主的脑炎、肠炎及肾炎等疾病，宿主范围广泛。先前的研究已证明狐狸感染的微孢子虫是兔脑炎微孢子虫，感染的幼狐在分窝前后发病，食欲不济、嗜睡、毛皮粗糙，严重的还会出现神经系统疾病及肉芽肿性脑炎，给狐狸养殖业造成巨大损失。我们的研究表明可利用基因重组技术表达微孢子虫孢壁蛋白SWP1建立 ELISA诊断方法。但它常依赖实验室专有的仪器、设备与人员。因此建立一种便宜、快速、准确的诊断方法意义重大。
　　本研究以提纯的狐狸IgG为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术，制备杂交瘤，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆，得到3株能稳定分泌针对狐狸IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为E2、1E3、2G10。Western Blot结果显示，这3株单抗能和狐狸 IgG特异性结合。抗体亚型鉴定表明，E2、1E3和2G10的重链均为 IgG1，轻链均为 Kappa链。生产提纯的1E3杂交瘤腹水单抗经Western Blot检测发现效价可达6000。将微孢子虫孢壁蛋白SWP1基因片段克隆到含GST标签的PcoldⅢ载体中，利用原核表达系统在BL21中表达并用GST抗体柱亲和层析方法纯化蛋白。利用1E3细胞株产生的单克隆抗体及感染微孢子虫的狐狸血清对提纯的SWP1蛋白进行检测，ELISA结果显示，SWP1蛋白可以作为抗原用来检测狐狸血清中相应的抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备30nm左右胶体金颗粒，胶体金标记单抗1E3，标记浓度为48μg/mL，将金标抗体1E3复合物稀释2倍后包被在金标垫上，同时将SWP1蛋白与兔抗狐狸IgG多克隆抗体以1.0mg/mL与1.6mg/mL的浓度分别包被MILLIPORE135膜作为检测线与质控线的检测蛋白。组装的试纸条能特异性检测感染微孢子虫狐狸的血清抗体，与感染弓形虫、隐孢子虫、新孢子虫的狐狸血清抗体无交叉反应。测试结果表明试纸条具有良好的重复性。在灵敏性试验中能检测到1:100稀释的阳性血清抗体。在样品检测中，最高能检测稀释10倍的样品血清抗体。在4℃与-20℃密封保存4个月后，试纸条检测结果良好，而37℃放置试纸条失效。利用抗狐狸 IgG单克隆抗体制备的检测感染微孢子虫的狐狸血清抗体试纸条具有良好的特异性与灵敏性，可以作为检测微孢子虫的一种快速诊断方法。

目录

1绪论

1.1微孢子虫概述

1.2单克隆抗体技术

1.3胶体金免疫层析技术

1.4本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

3实验结果

3.1狐狸IgG的提纯

3.2细胞融合

3.3抗原的最佳包被浓度的确定

3.4单克隆抗体细胞株上清Western Blot结果

3.5单克隆抗体亚型鉴定

3.6腹水单抗的纯化

3.7 SWP1蛋白的浓度与ELISA检测结果

3.8兔子多抗琼脂扩散试验

3.9胶体金标记的最佳蛋白量

3.10检测线SWP1蛋白及质控线兔抗狐IgG多抗的浓度确定

3.11试纸条结果判定

3.12特异性试验

3.13重复性试验

3.14灵敏性试验

3.15稳定性试验

4讨论

4.1动物免疫

4.2细胞融合

4.3制备饲养细胞

4.4阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆

4.5抗体的大量制备与纯化

4.6胶体金试纸条的制备

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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