电针对帕金森病大鼠抗脑组织氧化损伤及神经保护作用的实验研究

摘要

目的：帕金森病(PD)是常见的中枢神经系统慢性退行性疾病，严重威胁着中老年人的身体健康和生活质量。本研究采用颈、背部皮下注射鱼藤酮溶液制备PD大鼠模型，拟用补肾养肝填髓、熄风通络止颤法，观察电针百会、三阴交、太冲穴对实验性PD大鼠行为学、中脑黑质超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量的影响，探讨其抗脑组织氧化损伤的作用机制；观察其对中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺(DA)能神经细胞凋亡的影响，探讨其对PD大鼠DA能神经元的保护作用，进一步研究针灸治疗PD的作用机制。
　　方法：
　　78只Wistar大鼠均自然光照，自由饮水进食，正常饲养1周后，随机选取58只作为模型组大鼠，采用颈、背部皮下注射鱼藤酮溶液0.8mg/kg·d，(溶剂为二甲基亚砜，浓度为2mg/ml)28d制备PD大鼠模型；其余20只作为正常组注射等体积的溶剂。造模结束后，通过网格实验、悬挂实验和开阔实验对比模型组和正常组大鼠的行为学变化，模型组和正常组各随机选取10只剖杀，观察组织形态和神经生化变化，以判定造模成功与否。造模成功后将模型组大鼠随机分为模型组、西药组和电针组。
　　动物模型建立后次日开始治疗，西药组大鼠每日给予美多巴混悬液灌胃1.67mg/kg·d(生理盐水配制的浓度为25mg/ml的美多巴混悬液)；电针组大鼠每日按顺序给予治疗，将大鼠固定在自制束鼠器上，参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》，选百会、三阴交、太冲穴，用ψ0.30mm×13mm毫针刺入，接韩氏电针仪，采用疏密波，频率疏波2Hz、密波80Hz，强度2.0mA，10min/次·d，西药组和电针组均7d/疗程，共治疗2个疗程，疗程间休息1d；除西药组外，其余各组均灌服等体积的生理盐水；除电针组外，其余各组均采用同一体位固定10min/次·d。治疗均由同一操作者操作。
　　治疗结束后，观察大鼠包括悬挂实验、网格实验及开阔实验在内的行为学变化后，将大鼠脱臼处死取脑，右脑取中脑黑质行黄嘌呤氧化酶法测定脑组织SOD活力，比色定量分析法测定GSH、GSH-Px含量，硫代巴比妥酸比色分析法测定MDA含量。左脑行中脑黑质TH免疫组化(S-P法)染色检查和TUNEL法检测DA能神经细胞凋亡。连接显微图像分析系统测量平均光密度值(AOD)。
　　结果：
　　1造模第28天模型组和正常组观察指标比较
　　1.1模型组和正常组大鼠行为学比较
　　悬挂实验：模型组评分值明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；网格实验：模型组大鼠移动潜期长于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；开阔实验：模型组大鼠静止性蹲坐时间长于正常组(P<0.05)，而站立时间短于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　1.2模型组和正常组大鼠中脑黑质SOD活力、GSH、GSH-Px、MDA含量比较
　　正常组大鼠SOD活力高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；GSH含量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；GSH-Px含量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；MDA含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　1.3模型组和正常组大鼠中脑黑质TH及DA能神经细胞凋亡比较
　　正常组中脑黑质DA能神经元形态完整，细胞排列相对整齐；核呈圆形或锥形，大而清晰，核仁明显；神经纤维排列整齐，结构紧密。模型组神经元部分轻度肿胀，体积增大，细胞间隙增宽；细胞核形态不一，体积增大，偏居一侧，核仁不明显；神经纤维排列紊乱，结构疏松。
　　正常组中脑黑质TH免疫反应阳性神经元呈棕褐色，密集分布，数量较多，胞体较大，神经元突起明显。模型组中脑黑质TH免疫反应阳性神经元数目明显减少，神经元胞体轮廓及突起不清晰。统计学处理AOD值显示，模型组大鼠黑质TH阳性细胞数与正常组相比明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　与正常组相比，模型组出现大量凋亡细胞，统计学处理AOD值显示，模型组大鼠黑质凋亡细胞数明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2治疗前后正常组、模型组、西药组和电针组观察指标比较
　　2.1治疗前后各组大鼠行为学比较
　　悬挂实验：治疗前模型组、西药组和电针组评分值均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后模型组评分值低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组评分值高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组评分值与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组评分值与西药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　网格实验：治疗前模型组、西药组和电针组大鼠移送潜伏期均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后模型组大鼠移动潜伏期高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；西药组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组与西药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　开阔实验：治疗前模型组、西药组和电针组大鼠静止性蹲坐时间均高于正常组，站立时间均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后电针组和西药组静止性蹲坐时间均低于模型组，站立时间均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)；电针组静止性蹲坐时间与西药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，站立时间低于西药组，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　2.2治疗后各组大鼠中脑黑质SOD活力、GSH、GSH-Px、MDA含量比较
　　SOD活力比较：模型组低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组与模型组相比，差异无显著意义(P>0.05)；电针组高于西药组，差异有统计学意义(P<0.01)。GSH含量比较：模型组低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组与西药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。GSH-Px含量比较：模型组低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；电针组高于西药组，差异有统计学意义(P<0.01)。MDA含量比较：模型组高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与西药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　2.3治疗后大鼠中脑黑质Th及DA能神经细胞凋亡的变化
　　模型组与正常组相比DA能神经元部分轻度肿胀，体积增大，细胞间隙增宽；细胞核形态不一，体积增大，偏居一侧，核仁不明显；神经纤维排列紊乱，结构疏松。电针组与模型组相比DA能神经元改善明显，神经元肿胀减少减轻，体积变小，细胞间隙变窄；细胞形态较规则，体积较正常，核仁较明显，神经纤维排列较整齐，结够较密集，西药组改善差于电针组，优于模型组。
　　模型组与正常组相比TH免疫反应阳性神经元数目明显减少，神经元胞体轮廓及突起不清晰。电针组与模型组相比TH改善明显，阳性神经元数目增多，神经元胞体轮廓及突起较情。西药组改善差于电针组，优于模型组。电针组、西药组均差于正常组。统计学处理AOD值显示，模型组与正常组相比，TH阳性神经元数减少，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与模型组相比，TH阳性神经元数增加，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组与模型组相比，TH阳性神经元数增加，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与西药组相比，TH阳性神经元数增加，差异有统计学意义(P<0.01)。
　　模型组与正常组相比中脑黑质DA能神经细胞凋亡明显，模型组出现大量凋亡细胞。电针组、西药组与模型组相比凋亡细胞减少，且电针组凋亡细胞数少于西药组。统计学处理AOD值显示，模型组与正常组相比，凋亡细胞数增加，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与模型组相比，凋亡细胞数减少，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组与模型组相比，凋亡细胞数减少，差异有统计学意义(P<0.01)；电针组与西药组相比，凋亡细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。
　　结论：
　　1采用颈、背部皮下注射鱼藤酮溶液制备PD大鼠模型，模型组动物出现行为学改变，抗氧化能力下降，中脑黑质DA神经元严重受损，数目减少，细胞凋亡明显，提示造模成功。
　　2采用电针百会、三阴交、太冲穴可以改善PD大鼠行为学变化。
　　3采用电针百会、三阴交、太冲穴可以提高PD大鼠脑组织的抗氧化能力。
　　4采用电针百会、三阴交、太冲穴可以加强对PD大鼠DA能神经元的保护作用。