FXR激动剂高通量药物筛选模型的建立及应用

摘要

本研究为寻找治疗心血管疾病以及糖尿病药物的先导化合物，利用哺乳动物单杂交技术与高通量筛选技术在细胞水平上，建立了以FXR为靶点的FXR激动剂的高通量筛选模型，为寻找治疗血脂异常疾病药物的先导化合物开辟了道路。 从肝细胞的总RNA中，利用RT-PCR扩增FXR-LBD基因，将此DNA序列连接到pBind载体上构建了融合表达载体pBind-FXR；合成含5个拷贝的GAL4 DNA结合序列(GAL4RE)并接到pGl3 promoter载体上构建了报告载体pGl3-GAL4。通过表达质粒和报告质粒共转染，瞬时转染进入细胞，通过测定报告基因荧光素酶的表达，进行FXR的激动剂功能性筛选。 CDCA是FXR的生理激动剂，有较高的激动活性，本研究选用CDCA作为筛选模型的阳性药。通过对转染条件的优化，建立起了稳定、灵敏，有较高的信噪比的FXR激动剂的高通量筛选模型。在本单杂交模型中，CDCA能明显提高荧光素酶的表达，并且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性增长，CDCA在50礛时对荧光素酶有最大诱导活性，其倍增数为12。 本研究还进一步将FXR的筛选模型进行了384孔板的微量化研究，微量化后，FXR激动活性对CDCA仍然呈浓度依赖增长关系，最大的诱导倍增比96孔板有所下降，为5倍。 应用此模型对微生物次生代谢产物库中的880个样品以及纯化合物库中的120个样品进行了筛选，从中得两个活性化合物CoQl0和F01WA2076A。 CoQ10能明显提高荧光素酶的表达，并且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性增长，对荧光素酶的最大诱导倍增数为5；F01WA2076A也能明显提高荧光素酶的表达，并且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性增长，对荧光素酶的最大诱导倍增数可达9以上。 本研究过程中制备了2608株真菌和1840株放线菌的次生代谢产物共8896个样品，供本模型以及其他模型的筛选。 本研究建立的FXR激动剂的高通量细胞筛选模型以及得到两个活性化合物CoQ10和F01WA2076A，为FXR相关疾病的药物研发和FXR生理机制的研究打下良好的基础。

目录

论文说明：缩略语一览表

声明

前言

文献综述

材料和方法

1.实验材料：

1.1.菌株和细胞株

1.2.载体

1.3.培养基

1.4.工具酶

1.5.试剂盒

1.6.试剂

1.7.试剂与溶液

1.8.主要仪器

2.研究方法

2.1.琼脂糖凝胶电泳

2.2.用EZ-10spincolum DNA Gel Extraction kit 系统回收目的DNA片段

2.3.冰冻CaCl2法制备DH5α感受态细胞

2.4.DNA连接产物转化DH5α感受态细胞的方法

2.5.小提质粒（碱裂解法）

2.6.快提质粒

2.7.大量制备目标载体

2.8.动物细胞的培养

2.9.共转染动物细胞（LipofectamineTM2000）

2.10.发光数检测

2.11.化合物的制备

结果与分析

1.FXR基因的扩增与测序

1.1FXR的基因信息

1.2人肝细胞总RNA的提取，cDNA单链的合成

1.3目的基因的扩增

1.4质粒pGME-T easy-FXR的构建

1.5测序结果与分析

2.表达质粒pBind-FXR的构建

3.报告质粒pGl3-GAL4的构建

4.大量制备目标载体

5.筛选模式的优化及评估

5.1pBind-FXR与pG5luc单杂交系统的实验

5.2pBind-FXR与pGL3-GAL4单杂交系统的优化

5.3pBind-FXR与pGL3-GAL4单杂交模型的评估

6.384孔板微量化实验

7.筛选样品化合物的制备

8.高通量筛选模型的应用

8.1CoQ10激动活性的研究

8.2F01WA2076A激动活性的研究

讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历