鸡传染性法氏囊病毒广西流行代表毒株免疫原性的研究

摘要

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的主要危害幼龄鸡的一种急性、高度接触性的传染病，除引起发病、死亡等直接的损失外，还可导致感染鸡产生免疫抑制，致使机体免疫应答降低和对其它疾病的易感性增高，造成更大的损失。基因突变所引起的1BDV超强毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)和不同血清亚型的出现，是造成目前现有商品疫苗免疫效力不高或免疫失败的主要原因之一。因此，及时分离并筛选具有代表性的地方流行毒株作为研制疫苗的候选毒株，并对其免疫原性和交叉免疫保护性进行试验就成为一项十分有意义而且非常必需的工作。 在之前的研究中，我们在对2000～2006年间分别来自广西、江苏、浙江、安徽、海南5个省的23个IBDV分离毒株的主要保护性抗原蛋白VP2基因的高变区序列进行比较分析后发现，分离株可明显分为2群：第1群为属于经典毒株(classicaI IBDV，cIBDV)的10个弱毒株及2个中等偏强毒力的分离株，第2群为属于vvIBDV的11个分离株。本课题选取分离自广西的属第2群的vvIBDV毒株BH11、TSC-2(9)和属第1群的中等偏强毒力株040124、YL052作为代表，与目前在生产上使用最广泛的商品疫苗株B87(in)和FW2512一起，进行了毒株血清亚型和致病力鉴定、毒株间交叉免疫保护等研究，目的是筛选出致病性强、免疫原性和免疫交叉保护性好的毒株作为研制疫苗的种毒。 首先，通过应用免疫兔子制备的抗IBDV高免血清，在鸡胚成纤维细胞(CEF)上对四个流行代表株040124、BH11、TSC-2(9)、YL052和2个疫苗株B87(in)、FW2512进行交叉中和试验。结果显示，6个毒株可分成2个不同的血清亚型：BH11为一个亚型，YL052、TSC-2(9)、040124与疫苗株B87(in)和FW2512为另一个亚型；通过聚类分析法分析了各亚型毒株之间的亲缘关性存在一定的差异。 第二，用四个分离株分别人工感染4周龄非免疫鸡，以比较和确定它们的致病性。实验从致死率、免疫器官指数(immune organs index，IOI)及法氏囊显微病理损伤评分分别进行评价。结果显示四个毒株对实验鸡的发病率均为100％；在各实验组与对照组的IOI比较中差异均显著(p<0.05)，表明它们均具有一定程度的致病性，但各毒株间的毒力差异较大，040124毒株的致死率(40％)和法氏囊显微病理损伤评分(5分)均为最高。 第三，通过制备四个分离株的单价灭活油乳剂疫苗(OEV)、多价灭活OEV(040124、TSC-2(9)、BH11)以及参考强毒株CJ801-BKF的OEV，分别进行商品疫苗毒株BS7(in)、FW2512对4个分离株的免疫保护试验、各分离株间的免疫交叉保护试验、多价灭活苗不同免疫剂量及其与CJ801-BKF株灭活苗的免疫保护对比试验。试验分别从攻毒后各毒株疫苗免疫组鸡的IOI、免疫保护指数(immune protection index，IPI)进行评价。结果显示，B87(in)和FW2512疫苗免疫组对四个分离株YL052、040124、BH11、TSC-2(9)、的IPl分别为80％、60％、70％、70％和70％、60％、70％、80％，表明这两个商品疫苗不能对流行毒株提供完全的保护；四个单价OEV对同源毒株均可产生100％保护，040124的OEV对BH11、TSC-2(9)、YL052的IPl分别为80％、80％、90％，交叉免疫保护性最好，其它三个毒株间的IPI则在40％～70％；在毒株免疫组与未免疫组的IOI比较观察中发现，分离株TSC-2(9)和YL052免疫组与未免疫组的差异显著(P<0.05)，而分离株040124和BH11免疫组与未免疫组的IOI差异则不显著(P>0.05)，综合两项指标的结果，证明毒株040124株的免疫原性最好；多价OEV三个免疫剂量的的IPI都在80％以上，最高的达100％，各免疫剂量的比较中，1mL的免疫组IPI显著高于0.25mL的免疫组(P<0.05)，而1mL免疫组与0.5mL免疫组差异不显著(P>0.05)，可以确定0.5mL为多价OEV的最佳免疫剂量；应用最佳免疫剂量的多价OEV所进行的免疫保护试验中，发现它对四个分离株的IPI达90％以上，而CJ801-BKF株灭活OEV对各BH11、TSC-2(9)、YL052、040124的IPl分别只有65％、75％、60％、50％；在对多价OEV、4个单价OEV和CJ801-BKF株OEV的IPI比较中，多价OEV的免疫效力显著高于YL052、TSC-2(9)株和CJ801-BKF株的OEV(P<0.05)，各毒株OEV之间及其与CJ801-BKF株OEV以及多价OEV与毒株040124、BH11株OEV之间的差异均不显著(P>0.05)。综合以上结果，证明本研究制备的多价灭活OEV的免疫效力最高,适用于本地IBD的防制。 本课题研究的结果表明，广西存在不同的IBDV血清亚型的流行，商品疫苗B87(in)和FW2512已不能对流行毒株提供完全的保护，研发多价油乳剂灭活疫苗是本地防控IBD一种有效的策略。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1 IBD的发病历史

1.1.1 IBD在世界范围内的流行情况

1.1.2 IBD在中国流行情况

1.2 IBDV病原学

1.2.1病毒分类、形态特征和理化特性

1.2.2病毒基因组结构及功能特性

1.2.3 IBDV抗原变异的分子基础

1.2.4 IBDV毒力变异的分子基础

1.3 IBDV的致病机理及免疫抑制

1.4流行病学特点

1.5临床症状与病理变化

1.6诊断技术与防制策略的研究进展

1.6.1 IBD的诊断技术

1.6.2 IBD的防制策略

1.7疫苗选择及研究进展

1.8本研究的目的和意义

第二章鸡传染性法氏囊病毒广西流行毒株血清亚型的鉴定

2.1材料和方法

2.1.1 IBDV野毒株

2.1.2 IBDV疫苗毒株

2.1.3实验鸡胚

2.1.4实验用兔

2.1.5兔抗IBDV高免血清的制备

2.1.6组织培养半数感染量(TCID50)的测定

2.1.7细胞病毒血清中和试验

2.1.8聚类分析

2.2试验结果

2.2.1毒株微量交叉中和试验结果及血清亚型的分析结果

2.2.3毒株抗原聚类分析结果

2.3小结与讨论

第三章四个IBDV广西分离株致病性的研究

3.1材料与方法

3.1.1试验用鸡

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.1.4试验毒株

3.1.5 IBD高免血清

3.1.6抗原的准备

3.1.7试验设计

3.1.8鸡感染IBDV后法氏囊显微病理损伤的评分标准

3.1.9组织切片制作步骤

3.2试验结果

3.2.1攻毒后病死鸡及扑杀未死亡试验鸡的细菌检查和琼脂扩散试验结果

3.2.2四个分离株感染试验鸡后的致死率、免疫器官指数、法氏囊显微病理损伤的评分

3.2.3试验鸡临床症状及剖检病理变化

3.2.4病理组织学观察

3.3小结与讨论

第四章IBDV广西流行毒株的免疫保护试验

4.1材料与方法

4.1.1 IBDV野毒株

4.1.2 IBDV疫苗毒株

4.1.3标准强毒株

4.1.4试验用鸡

4.1.5油乳剂灭活疫苗的配制

4.1.6商品疫苗B87(in)、FW2512对四个IBDV广西分离株的免疫保护试验

4.1.7四个分离株间交互免疫保护试验

4.1.8多价油乳剂灭活疫苗不同剂量的免疫保护对比试验

4.1.9多价油乳剂灭活疫苗与CJ801-BKF株灭活疫苗的免疫保护对比试验

4.1.10病理阳性判断指标

4.2试验结果

4.2.1攻毒后病死鸡及扑杀未死亡试验鸡的细菌检查和琼脂扩散试验结果

4.2.2 B87(in)和FW2512对各分离株的免疫保护试验结果

4.2.3各分离株间交叉免疫保护试验结果

4.2.4各分离株疫苗免疫鸡在攻毒后7天法氏囊和胸腺的病变

4.2.5多价油乳剂灭活疫苗不同剂量的免疫保护对比试验

4.2.6多价油乳剂灭活疫苗与CJ801-BKF株灭活疫苗的免疫保护对比试验结果

4.3小结与讨论

第五章结论与讨论

参考文献

致谢

个人简历