EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌诊治中的研究及以分子标记物预测、监测鼻咽癌骨转移的研究

摘要

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一，尤在华南地区最常见。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，对局部晚期鼻咽癌，目前的标准治疗是同期放、化疗，但对远处转移的控制并不理想。目前的临床分期系统尚未能有效地预测局部晚期患者接受同期放、化治疗后是否仍有远处转移的风险，因此有必要寻找一项新的分子生物学指标筛选易发生远处转移的高危患者，指导临床进行最适宜的个体化的放、化综合治疗。EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)感染是鼻咽癌的病因之一，血浆EBV DNA浓度与鼻咽癌的分期、疗效、预后相关，但血浆EBV DNA浓度与肿瘤负荷的关系，以及不同时期(治疗前、治疗后)EBV DNA的临床意义，目前尚未明确。在本研究的第一部分，我们探讨了NPC患者治疗前、后血浆EBV DNA浓度与肿瘤负荷、临床疗效，尤其是远处转移的关系，探索其作为分子分期指标指导临床治疗选择的可行性。 骨是鼻咽癌远处转移最常见的部位，骨转移瘤可导致疼痛、运动功能障碍以及骨相关事件(Skeletal-related events,SREs，包括病理性骨折、脊髓压迫等)等严重后果，显著降低患者的生活质量、缩短生存期，是影响恶性肿瘤治疗成败与患者生存的主要因素之一。在骨转移瘤引起骨破坏的发生机制中，包括细胞因子的趋化、转化作用及破骨细胞与成骨细胞的相互作用。骨唾液酸蛋白(Bonesialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是由成骨细胞、破骨细胞等合成的细胞外基质中的糖蛋白。近年的研究发现多种肿瘤细胞表面表达有BSP、OPN，这两种蛋白介导肿瘤细胞容易粘附于成骨细胞、破骨细胞形成骨转移病灶。由此认为，这两种蛋白的表达与恶性肿瘤骨转移相关，可能是预后不良及早期发生骨转移的预测指标。本研究第二部分将检测鼻咽癌患者肿瘤组织中BSP和OPN的表达情况，并分析其表达与鼻咽癌骨转移及预后的关系。双磷酸盐的应用是恶性肿瘤骨转移治疗策略中的重要部分，但在鼻咽癌骨转移的患者中双磷酸盐应用的研究较少，能否预防或减少SREs的作用不详。近年来有研究报道，通过监测一些特异性反映骨溶解的骨代谢生化指标(Bonemarker)如：骨基质Ⅰ型胶原的降解产物氨基末端肽(N-telopeptide，NTx)的水平(尿NTx的水平)，可以有效地预测双磷酸盐治疗实体瘤骨转移时SREs发生的风险，监测骨破坏、骨修复的情况。本研究第三部分将有骨转移的鼻咽癌患者随机分成两组，一组在应用常规化疗的基础上使用唑来磷酸治疗，另一组单纯化疗，比较两组患者治疗过程中尿NTx变化的差别，初步评价唑来磷酸治疗鼻咽癌骨转移效果。 第一部分血浆EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌诊治中的应用研究 目的：EB病毒感染与鼻咽癌发病密切相关，本研究探讨治疗前、后血浆EBVDNA浓度与鼻咽癌肿瘤负荷、预后的关系。 方法：69例初治鼻咽癌患者分别在治疗前、后采用荧光定量PCR方法检测血浆EBV DNA浓度。通过逐层叠加CT/MRI上勾画的鼻咽大体肿瘤体积和区域淋巴结体积之和计算为肿瘤体积。所有患者按计划随访，进行远期疗效及生存的评价。EBV DNA浓度与肿瘤体积的关系用Spearman相关系数表示，EBV DNA浓度组间比较用Kruskal-Wallis秩和检验，EBV DNA检出率组间比较用x<'2>检验，寿命表法计算生存率，Kaplan-Meier法比较生存情况，并进行Log-rank检验，Cox比例风险模型进行预后的多因素分析。 结果：治疗前血浆EBV DNA浓度与肿瘤体积显著相关(Spearman相关系数0.590；P<0.001)。远处转移患者治疗前血浆EBV DNA中位浓度(27000copies/ml)及治疗后EBV DNA检出率(55.56﹪)均高于持续缓解者(4000eopies/ml，5.56﹪)及局部复发者(3850copies/ml，0﹪)，P值分别为0.039，0.001。以治疗前20000copies/ml，治疗后转阴性(0 copies/ml)为界值点，治疗前、后EBV DNA低浓度患者的无复发生存率、无转移生存率及总生存率均高于高浓度患者，差异有统计学意义。综合治疗前后血浆EBV DNA浓度的生存分析显示无论治疗前EBV DNA是否大于20000copies/ml，治疗后EBV DNA转阴性的患者均有较好的无转移生存(P=0.000)。Cox回归分析显示治疗后血浆EBV DNA能否转阴性是远处转移唯一的独立预后因素(P=0.004，HR=16.491)。 结论：治疗前、后EBV DNA浓度在鼻咽癌诊治中均具有不同的重要临床意义。治疗前EBV DNA反映肿瘤负荷，预测疗效和生存，而治疗后血浆EBV DNA能否清除则能有效地预测远处转移的风险。 第二部分 BSP、OPN在鼻咽癌的表达及预测鼻咽癌骨转移的研究 目的：骨是鼻咽癌最常发生的转移部位，目前尚无预测鼻咽癌骨转移的标记物。本研究探讨鼻咽癌组织中BSP、OPN的表达及与鼻咽癌患者临床特征、预后，尤其是骨转移的关系。 方法：本研究收集1999年5月至2005年4月在中山大学肿瘤防治中心确诊的136例Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌初诊患者鼻咽活检石蜡标本，制作成鼻咽癌组织芯片。应用免疫组织化学方法检测BSP、OPN蛋白的表达情况。蛋白表达情况组间比较用Kruscal-Wallis秩和检验，寿命表法计算生存率，Kaplan-Meier法比较生存情况，并进行Log-rank检验，Cox比例风险模型进行预后的多因素分析。 结果：在136例鼻咽癌组织中BSP的阳性率为87.5﹪(H9/136)，阳性表达部位在肿瘤细胞胞膜及胞浆。OPN的阳性率为85.9﹪(117/136)，阳性表达部位主要在肿瘤细胞胞膜及胞浆。BSP在未分化型非角化性癌(WHO分型：Ⅲ型)组织中的表达率高于分化型非角化性癌(WHO分型：Ⅱ型)(91﹪vs．72﹪，P=0.01)，在其它各临床指标组间的差异无统计学意义。OPN在初诊时有远处转移的患者肿瘤组织中的表达率高于无转移者(100﹪vs．85.6﹪，P=0.03)，在其它各临床指标组间无差异。在有完整随访资料的119例患者，骨转移患者的BSP高表达率与骨外转移患者、无转移患者无明显差异(68.8﹪vs．71.4﹪vs．50.6﹪，P=0.18)，OPN高表达率明显高于骨外转移患者、无转移患者，差异有统计学意义(56.3﹪vs．42.9﹪vs．27.0﹪，P=0.05)。BSP高表达组与低表达组的2年无骨转移生存率、无骨外转移生存率、总生存率分别是82.10﹪vs．89.22﹪(P=0.31)、75.70﹪vs.85.99﹪(P=0.22)、86.40﹪vs.91.28﹪(P=0.68)，差异均无统计学意义。OPN高表达组与低表达组的2年无骨转移生存率、无骨外转移生存率、总生存率分别是77.09﹪vs.89.41﹪(P=0.06)、70.21﹪vs.85.01﹪(P=0.03)、90.80﹪vs.87.38﹪(P=0.89)。 结论：BSP、OPN蛋白在鼻咽癌组织中高表达。BSP蛋白的表达与鼻咽癌的侵袭、转移无明显相关。OPN蛋白的表达与鼻咽癌骨转移的发生初步显示出一定关系，值得在扩大样本量的试验中进一步证实，帮助筛选高危患者进行更紧密的随访及预防性治疗。 第三部分唑来磷酸降低鼻咽癌骨转移患者尿氨基末端肽的前瞻性、随机、开放的临床研究 目的：评价唑来磷酸联合抗肿瘤治疗与单纯抗肿瘤治疗降低鼻咽癌骨转移患者的尿氨基末端肽(NTx)水平的差异。 方法：20例初治鼻咽癌骨转移患者随机分组，分别接受唑来磷酸(4mg，每4周1次，连续3次)联合抗肿瘤治疗及单纯抗肿瘤治疗。所有患者在入组第1、5、9、10周采用酶联免疫吸附法检测尿NTx值。主要研究终点是尿NTx的改变(与基线水平相比治疗3月后尿NTx的变化率)。 结果：试验组平均基线尿NTx值为60.97±11.85 nM BCE/mM，末次随访平均尿NTx值为30.31±8.61 nM BCE/mM，差异有统计学意义(P=0.01)。对照组平均基线尿NTx值为59.71±8.49 nM BCE/mM，末次随访平均尿NTx值为68.79±43.74 nM BCE/mM，较基线值上升(P=0.73)。试验组NTx变化率平均为-35.31﹪，对照组为+8.23﹪，试验组NTx下降，对照组上升(P=0.32)。 结论：鼻咽癌骨转移患者在标准抗肿瘤治疗基础上使用唑来磷酸，显著降低尿NTx值，减少转移瘤引起的骨溶解。其疗效有待扩大临床研究进一步证实。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分血浆EB病毒DNA定量检测在鼻咽癌诊治中的应用研究

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

第二部分BSP、OPN在鼻咽癌的表达及预测鼻咽癌骨转移的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

第三部分唑来磷酸降低鼻咽癌骨转移患者尿氨基末端肽的前瞻性、随机、开放的临床研究：中期分析

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

结论

参考文献

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