骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞方向分化的比较实验研究

摘要

目前，干细胞移植已经成为中枢神经系统（central nerve system，CNS）损伤特别是脊髓损伤（spinal cord injury，scD后功能恢复研究的热点。适合进行移植的细胞有成体间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）以及嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、雪旺氏细胞（schwann cells，SCs）等。主要机理在于，移植的细胞可以在CNS的神经组织内长期存活，分泌神经营养因子、改善损伤区局部微环境，替代变性坏死的神经细胞，从而促进受损伤神经细胞轴突生长，其中ESCs取材困难、且涉及免疫排斥和伦理道德等问题；而MSCs来源丰富、取材方便、适合自体移植而不受伦理约束、且没有免疫排斥反应，具有高度自我更新和多向分化能力，故被广泛应用于再生医学研究。 第一部分 ADSCs和BMSCs的取材与传代培养。 目的:建立获取、传代培养及初步鉴定大鼠ADSCs和BMSCs的技术体系，为下一步诱导分化及其比较实验研究奠定基础。 方法:1.ADSCs的取材、传代采用酶消化法分离ADSCs。主要步骤：无菌麻醉条件下取SD成年大鼠的腹部脂肪组织，剪碎后用2.5%的Ⅰ型胶原酶37℃条件下消化60nun；之后1200rpm离心8min，弃去上层的脂肪和中间的液体，将底部的细胞重悬、以1200rpm离心8min后弃去上清，加入5ml含10%FBS的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于底面积25c㎡的一次性培养瓶中，置5%CO2、37℃、饱和湿度细胞培养箱中培养；每周换液2次。贴壁细胞达到90%融合时按1：3传代。共传5代以后进行细胞诱导。 2.BMSCs的取材、传代采用全骨髓培养的方法分离BMSCs。主要步骤：无菌麻醉条件下取同一只成年SD大鼠的股骨和胫骨，用DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液经1000rpm离心8min后弃去上清，加入5ml含10%FBS的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于底面积25c㎡的一次性培养瓶中，置5%CO2、37℃、饱和湿度细胞培养箱中培养，2d后弃去未贴壁细胞；每周换液2次。贴壁细胞达到90%融合时按1：3传代。共传5代以后进行细胞诱导。 3.干细胞特征检测：以CD44为一抗对原代细胞进行免疫细胞化学检测。以CD29、CD34、CD44、CD90为细胞表型对第5代细胞进行流式细胞仪检测，分别确定ADSCs和BMSCs的干细胞特征。 结果:原代BMSCs于2d后贴壁，7d后90%融合；传代细胞的增殖潜伏期明显变短，达到90%融合需要5d左右；第5代细胞均匀一致。原代ADSCs于1d后贴壁，9d90%融合；传代细胞的潜伏期明显变短，达到90%融合需要5d左右；倒置相差显微镜下可观察到第5代细胞形态均匀一致，呈梭形，排列比第5代BMSCs稍整齐。经CD44免疫细胞化学和以CD29、CD34、CD44、CD90为细胞表型的流式细胞仪检测证实其具有干细胞特征。 讨论及结论:采用酶消化法获得的ADSCs和经过贴壁法所获得的BMSCs，在传至第5代时、细胞形态一致，排列整齐；经鉴定，传代后的ADSCs和BMSCs仍拥有干细胞特征，适合进一步诱导分化研究。 第二部分 ADSCs和BMSCs诱导分化为神经元样细胞。 目的:比较传代培养至第5代的ADSCs和BMSCs在分别加入“bFGF+ EGF”之后的诱导分化规律，以及两种细胞诱导分化为神经元样细胞的差异。 方法:对传代培养至第5代的ADSCs和BMSCs，以含有0.5%胎牛血清的DMEM/F12，加入10ng/ml表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）进行诱导分化。3d后补充一次因子，7d换液，细胞90%融合后按1：2传代。用Western blot和免疫组化法观察诱导各个时间点（6h、12h、24h、72h、1w、2w）细胞表达神经标志物（Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP）的情况，并做统计学分析。观察诱导1w后细胞在扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）下的形态学特征。 统计学分析照片由CCD成像系统获得。阳性细胞计数方法：选取3个样本，每个样本随机取10个不重叠视野（200×），选取100个细胞，计数阳性细胞个数，并做统计学分析。阳性率用“均数±标准差”表示；比较两种来源细胞（ADSCs和BMSCs）同一个时期同一种染色的阳性率采用“独立样本的t检验”；两种细胞同一种染色随时间变化规律采用“单向方差分析”。统计软件用SPSS（版本13.0）、P<0.05为有显著性差异、有统计学意义。 结果:诱导前，ADSCs和BMSCs中的少量细胞呈Nestin阳性染色，显微镜观察亦有少量神经元样细胞存在；诱导后，ADSCs和BMSCs均分化出更多的神经元样细胞，但其中由BMSCs分化的神经元样细胞突起更长，诱导后72h，诱导细胞相连形成网状。具体变化：给予bFGF+EGF诱导6h后，两种细胞即出现形态学上的改变，即诱导分化后的BMSCs（differentiated BMSCs，dBMSCs）和诱导分化后的ADSCs（differentiated ADSCs，dADSCs）开始收缩、形成胞体呈圆形的多突起细胞，表达Nestin阳性的dADSCs和dBMSCs分别迅速增至75.2±2.8和55.2±2.8。随着诱导时间点延长、Nestin阳性的细胞在dADSCs和dBMSCs的表达均呈下降趋势，诱导72h和1w后，dADSCs和dBMSCs均检测不到Nestin阳性细胞；诱导后24h，dADSCs和dBMSCs表达神经元标志物β-tubulinⅢ，其阳性率均在诱导1w时达到稳定表达水平，并保持到2w；同时，dADSCs和dBMSCs都很少分化为表达GFAP阳性的细胞。 统计学结果表明，dADSCs随时间变化的Nestin阳性表达渐少（F=1877.764，P=0.000）、β-tubulinⅢ阳性表达渐增（F=882.435，P=0.000）趋势，均具有统计学意义（P<0.05）；同时，dBMSCs随时间变化的Nestin阳性表达渐少（F=2158.746，P=0.000）和β-tubulinⅢ阳性表达渐增（F=1800.764，P=0.000）趋势亦具有显著性差异（P<0.05）。由此提示，本研究采用的诱导方法可以成功地将ADSCs和BMSCs诱导为神经元样细胞。而经过ADSCs和BMSCs在诱导后不同时间点同一种染色阳性率的比较，均显示为P<0.05，提示每种染色阳性率的变化在不同时间点都有显著性差异、具有统计学意义；其中dADSCs随诱导时间递增而表达β-tubulinⅢ逐渐增强的能力（24h、72h、1w、2w分别为35.0±6.4、62.7±2.2、87.0±2.5、83.2±5.1）明显大于dBMSCs（24h、72h、1w、2w分别为10.1±2.7、46.5±2.4、68.6±5.1、70.5±3.8），表明dADSCs向神经元样细胞分化的能力、比dBMSCs更强。Western blot结果也支持上述推论。 讨论及结论:本实验结果提示，经过特定细胞因子的诱导，ADSCs和BMSCs可以发生形态学和表型的变化，分化为神经元样细胞。在诱导前，Nestin和GFAP在ADSCs和BMSCs呈低水平表达，而β-tubulinⅢ随着诱导时间的延长，在dADSCs和dBMSCs中逐渐呈显著表达趋势，提示在本实验条件下，dADSCs和dBMSCs随着诱导时间的递增而逐渐趋向于向神经元样细胞分化。值得一提的是，本实验发现两种来源的MSCs，虽经bFGF和EGF诱导、却仍极少分化为GFAP阳性的细胞，在提示ADSCs和BMSCs具有一定可塑性的同时、也提示了微环境对这两种干细胞向神经元样细胞或神经胶质样细胞方向诱导分化的影响作用。 由ADSCs和BMSCs在相同诱导条件下出现显著差异的分化结果可以推测，dADSCs分化为β-tubulinⅢ阳性细胞的能力更强，与BMSCs相比、ADSCs具有更强的向神经元样细胞方向分化的潜能；在中枢神经疾病的治疗和损伤修复方面，可考虑以ADSCs作为BMSCs的替代、成为新的干细胞种子源。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文所缩写对照表

声明

前言

第一部分原代细胞的获取、传代、鉴定

1实验仪器、材料和试剂

2实验方法

3实验结果

4讨 论

5参考文献

6第一部分图片及说明

第二部分第5代细胞的诱导

1实验仪器、材料和试剂

2实验方法

3实验结果

4讨论

5参考文献

6第二部分图片及说明

综述 硫酸软骨素蛋白多糖对脊髓损伤后功能恢复的影响

成果

致谢

统计学证明